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.2003年3月4日；100(5):2819-24.
doi:10.1073/pnas.262787699。 Epub 2003年2月24日。

P/Q型钙通道重建突触传递对突触蛋白相互作用位点的需求

本田秀美子 1, 露丝·E·韦斯坦布鲁克, 查尔斯·T·横山由纪夫, 钟慧君, 斯科特·迈尔斯, 托德·谢尔, 伊藤佳彦, 威廉·A·卡特尔
附属公司

P/Q型钙通道重建突触传递对突触蛋白相互作用位点的需求

本田秀美子等。 美国国家科学院院刊. .

摘要

在细胞培养的颈上神经节神经元中表达了传导P/Q型Ca（2+）电流的Ca（v）2.1通道，并测量了这些外源性表达的Ca。Ca（v）2.1通道结构域II和III之间的细胞内环中突触蛋白相互作用（synrint）位点的缺失降低了它们在突触传递中的有效性。令人惊讶的是，这种效应与外源性表达通道突触前定位的丢失有关。传导L型Ca（2+）电流的Ca（v）1.2通道在支持突触传递方面无效，但将Ca（v1.2）中Ca（v-2.1通道的合成蛋白位点替换为Ca（V1.2）中的合成蛋白足以建立由L型Ca2+电流通过外源Ca（v-1.2通道启动的突触传递。从传导N型Ca（2+）电流的Ca（v）2.2通道替换合成蛋白位点甚至比Ca（v2.1更有效。我们的结果表明，外源性Ca（2+）通道在颈上神经节神经元神经末梢的定位和功能需要一个功能性合成位点，并提示可溶性NSF连接蛋白受体（SNARE）的结合突触前Ca（2+）通道神经末梢定位的必要许可事件是合成蛋白位点的蛋白质。

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数字

图1
图1
细胞内连接结构域II和III的内嵌子/外显子结构、缺失突变体和嵌合体。外显子从Ca的跨膜段IIS6延伸到段IIIS1v（v）1和Cav（v）两个通道对齐以进行比较。编码相关氨基酸序列的外显子被放置在垂直寄存器中。与Ca外显子19和20相关的氨基酸序列v（v）Ca中不存在2个通道v（v）1个通道。钙的合成位点v（v）2.1以蓝色突出显示，Ca的合成位点v（v）2.2以黄色突出显示。Ca的氨基酸名称v（v）1.2，钙v（v）2.1和Cav（v）2.2个通道由GenBank登录号M67515、NP_03705和Q02294确定。
图2
图2
Ca的表达v（v）2.1 synprint站点中有缺失的通道。(A类)表达的野生型和突变型Ca的免疫印迹v（v）2.1. 编码Ca的cDNAv（v）2.1在tsA-201细胞中表达，用抗CNA4进行免疫印迹，如实验程序.从左到右的凝胶层表示转染Cav（v）2.1和synprint突变体Δ（864–934）、Δ（793–878）和Δ（771–971）。钙的预测分子量v（v）2.1和突变体，从左到右分别为252、244、242和229kDa。250kDa肌球蛋白和150kDa磷酸化酶B的染料偶联分子质量标准如左图所示。(B类–F类)野生型和突变型Ca表达的免疫细胞化学分析v（v）2.1. 对照条件下测试的tsA-201细胞(B类)或转染编码Ca的cDNAv（v）2.1 (C类), α12.1Δ(793–878) (D类), α12.1Δ(864–934) (E类)，或α12.1Δ(771–971) (F类)用抗CNA4抗体染色，如实验程序.
图3
图3
钙的功能v（v）2.1 synprint站点中有缺失的通道。(A类)选通的电压依赖性。激活：Ba2+在10-ms的测试脉冲期间，从−80 mV的保持电位记录到指示电位的电流。将电池复极到−40 mV持续3 ms。将尾电流归一化为每个测试脉冲系列中的最大尾电流，并将平均值±SEM绘制为测试电压的函数。钙v（v）2.1，填充圆(n个= 12); α12.1Δ（864–934），实心三角形(n个= 7); α12.1Δ（793–878），填充正方形(n个= 8). (插入)巴的代表2+在+20 mV下记录的电流。（校准棒：200 pA，2 ms）失活。文学士2+在10-ms测试脉冲至+30 mV期间，从−80 mV的保持电位记录电流。在将细胞复极至−80 m V持续20 ms后，对指示电位施加4-s预处理脉冲，然后再施加10 ms至+30 m V的第二个测试脉冲。将第二个测试脉冲的尾电流归一化为每个系列中的最大尾电流，并绘制为平均值±SEM与预脉冲电压的对比图。钙v（v）2.1，开环(n个= 10); α12.1Δ（793–878），开放三角形(n个= 3); α12.1Δ（864–934），方形开口(n个= 7). (B类)SNAP-25的作用。活化和失活的电压依赖性测量如下A类对于Cav（v）2.1，开放和填充圆(n个= 15); 钙v（v）2.1带SNAP-25，开放和填充的倒三角形(n个= 5); α12.1Δ（793–878），带SNAP-25，开放和填充正方形(n个= 4); 和α12.1Δ（864–934），带SNAP-25、开放三角形和填充三角形(n个= 3).
图4
图4
ω-琼脂毒素IVA对突触钙突变体传递的影响v（v）2.1通道。如中所述，从成对SCGN记录突触传递实验程序，ω-琼脂毒素IVA（250 nM）用于t吨=0（箭头）。(A类)从表达Ca的突触记录到EPSPv（v）2.1Δ(864–934) (n个= 7). (B类)从表达Ca的突触记录到EPSPv（v）2.1Δ(793–878) (n个= 6). (C类)从表达Ca的突触记录到EPSPv（v）2.1Δ(771–971) (n个= 5). (D类)在表达野生型Ca的突触处记录到EPSPv（v）2.1 (n个= 5). (E类)用滑动平均算法平滑归一化平均EPSP振幅值A类–D类根据记录时间绘制。(F类)显示施用毒素后20分钟EPSP平均值±SEM的条形图。*，与对照组相比P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.02.
图5
图5
钙的神经末端表达v（v）2.1在合成蛋白位点中有缺失的通道。用荧光标记的右旋糖酐硫酸盐标记的注入细胞通过共焦显微镜进行鉴定。然后改变过滤器，查看德克萨斯州红色标记抗体，以及在注射野生型或突变型Ca的细胞附近标记有抗CNA4或抗CNA5的细胞图像v（v）收集了2.1个cDNA。(A类) α12.1用抗CNA4。(B类) α12.1Δ（793–878），用抗CNA4标记。（C） α12.1Δ（864–934）标记抗CNA4。(D类) α12.1标有抗CNA5。(E类) α12.1Δ（793–878）标记抗CNA5。(F类) α12.1Δ（864–934）标记抗CNA5。(G公司)每段标记有抗CNA4或抗CNA5抗体的标记点的平均数量。使用METAMORPH（宾夕法尼亚州唐宁镇通用成像公司）图像分析程序计算穿孔数量。误差条表示平均值的标准误差。
图6
图6
嵌合体Ca的表达与功能v（v）1.2/Cav（v）2.1 syp和Cav（v）2.1/Ca（加利福尼亚州）v（v）2.2综合。如中所述，从成对SCGN记录突触传递实验程序和硝苯地平（2.5μM）或ω-琼脂糖IVA（250 nM）在t吨=0（箭头）。(A类)从表达Ca的突触中记录到EPSPv（v）1.2-印记嵌合体(n个= 5). (B类)从表达Ca的突触中记录到EPSPv（v）2.1-印记嵌合体(n个= 6). (C类)说明施用毒素20分钟后EPSP平均值±SEM的条形图。*，与对照组相比P（P）<0.05与学生t吨测试；syp、synprint。
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