PPARdelta is a very low-density lipoprotein sensor in macrophages

doi:10.1073/pnas.0337331100

.2003年2月4日；100(3):1268-73.

doi:10.1073/pnas.0337331100。 Epub 2003年1月22日。

PPARdelta是巨噬细胞中的一种极低密度脂蛋白传感器

阿杰·查拉¹, 李志浩, 亚科夫·巴拉克, 何伟民, 约翰·罗森菲尔德, 黛比·廖, Jungyeob Han先生, Heonjoong Kang公司, 罗纳德·M·埃文斯

附属公司

PMID： 12540828
预防性维修识别码：项目经理298762
内政部： 10.1073/pnas.0337331100

PPARdelta是巨噬细胞中的一种极低密度脂蛋白传感器

阿杰·查拉等。美国国家科学院程序. 2003.

.2003年2月4日；100(3):1268-73.

doi:10.1073/pnas.0337331100。 Epub 2003年1月22日。

作者

阿杰·查拉¹, 李志浩, 亚科夫·巴拉克, 何伟民, 约翰·罗森菲尔德, 黛比·廖, Jungyeob Han先生, Heonjoong Kang公司, 罗纳德·M·埃文斯

附属

¹美国加利福尼亚州拉霍亚霍华德·休斯医学院索尔克生物研究所，邮编90237。

PMID： 12540828
预防性维修识别码：项目经理298762
内政部： 10.1073/第0337331100页

摘要

虽然富含甘油三酯的颗粒物，如极低密度脂蛋白（VLDL），对人类动脉粥样硬化的形成有重要贡献，但脂蛋白驱动致病性的分子基础尚不清楚。我们证明，在巨噬细胞中，VLDL通过激活核受体过氧化物酶体增殖物激活受体δ发挥转录调节器的作用。天然VLDL的信号成分是其甘油三酯，其活性被脂蛋白脂肪酶增强。过氧化物酶体增殖物激活受体δ-空巨噬细胞的产生证实了该转录因子在介导VLDL反应中的绝对需求。因此，我们的数据揭示了饮食中的甘油三酯和VLDL可以直接调节动脉粥样硬化病变中的基因表达的途径。

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数字

图1
PPARδ被VLDL粒子激活。(A类)VLDL粒子可激活全长PPARδ。使用AOx-PPRE在CV1细胞中进行三次瞬时转染实验_三荧光素酶报告子构建物（0.1μg）和CMX-PPARδ/CMX-RXRα表达载体（每个10 ng），如*材料和方法*将转染细胞培养在脂蛋白缺乏的FBS中，并用配体或脂蛋白处理24小时，然后收集用于报告基因分析。荧光素酶活性被归一化，以提高内部β-半乳糖苷酶对照的转染效率。(B类)VLDL粒子通过PPARδ的配体结合域激活。CV-1细胞与嵌合受体GAL4DBD-PPARδLBD和UAS共转染_三荧光素酶报告基因。随后用不同浓度的cPGI、VLDL或VLDL与10μg/ml LPL混合处理转染细胞。(C类)VLDL反式PPARδ中存在甘油三酯。用GAL-PPAR（α、δ和γ）和UAS对CV-1细胞进行瞬时转染_三荧光素酶报告子。将甘油三酯与LPL（10μg/ml）混合在1%BSA中，然后添加到培养基中（最终浓度为50μM）。

图2
PPARδ缺陷ES细胞和巨噬细胞的生成。(A类)生成的目标方案*PPARδ*空ES单元格。G418-敏感ES细胞克隆IIIA4（23）包含WT杂合细胞的混合物*PPARδ*等位基因（+，底部)和一个空的“floxed-out”等位基因（−，顶部)或有条件的“floxed”等位基因（ck，未显示）。此克隆已使用包含*lacZ公司*基因敲入，破坏*PPARδ*第一锌指DNA结合基序的上游（lz，中间). 每个等位基因下方的花纹条代表了对生态当用3′-外部探针探测时，RI会清除DNA片段。限制地点：E，生态RI；不，*Nhe公司*一、(B类)PPARδ阴性ES细胞的Southern blot分析。通过重新定位IIIA4细胞产生的单个子克隆包含不同的双等位基因组合*PPARδ*：WT和新引入的lacZ敲除等位基因的细胞杂合（+/lz；第1道）；两个G418-抗性克隆携带原始IIIA4等位基因组合ck/+和+/-（分别为第2和第3道）以及neoR基因可能的非同源整合；以及本研究中功能分析的PPARδnull ES克隆（lz/−，车道4；*），其中里兹等位基因整合代替克隆IIIA4的剩余WT等位基因。使用5′外部探针（未显示）进一步确认等位基因身份。(C类)FACS分析*PPARδ*^+/+和*PPARδ*^−/−ES细胞源性巨噬细胞。巨噬细胞由ES细胞产生，如*材料和方法*WT或PPARδ阴性巨噬细胞用指示的抗体（深灰色）或同型对照（浅灰色）染色。巨噬细胞表面标记物包括F4/80、Mac-1（CD11b/CD18）和2.4G2（FcγRII/FcγRAII）。Gr.1（Ly-6G）是粒细胞谱系特异性标记，此处用作阴性对照。

图3
在PPARδ缺失的巨噬细胞中显著诱导VLDL受体。WT或*PPARδ*^−/−用载体、罗格列酮（1μM）、GW 501516（0.1μM）或VLDL（50μg/ml）处理ES-derived巨噬细胞24小时。通过Northern blotting分析总RNA（5μg），使用³²P标记的cDNA探针。通过与K-FABP cDNA探针杂交，在每条通道中都有等量的完整RNA。

图4
VLDL和PPARδ调节ADRP的表达。(A类)VLDL/LPL脂质负荷导致胞质ADRP的重新分布。将含有HA标记的小鼠ADRP的表达载体转染到培养箱载玻片上生长的CV-1细胞中。用VLDL/LPL处理24小时后，用抗HA抗体对细胞进行染色，并用FITC-偶联二级抗体进行观察。(B类)PPARδ和VLDL调节巨噬细胞中ADRP的表达。用cPGI（2μM）、GW 501516（0.1μM）或VLDL（25μg/ml）处理WT、PPARδ或γ阴性巨噬细胞24小时(C类)PPARδ的异位表达赋予细胞VLDL反应性。用载体、cPGI（2μM）、LG 268（0.1μM）或VLDL（100μg/ml）处理NIH载体和NIH-PPARδ细胞24小时。用Northern blots和³²P标记的cDNA探针。

图5
ADRP启动子是VLDL和PPARδ/RXR异二聚体直接调控的靶点。(A类)ADRP启动子含有一个PPRE。包含WT、点突变和ADRP启动子内部缺失的报告结构的示意图。潜在的PPRE位于ADRP启动子的−2004和−1992 bp之间。凝胶迁移率变化分析使用*在体外*翻译蛋白和³²P末端标记的ADRP和酰基辅酶A氧化酶（AoX）PPRE寡核苷酸。PPARα/RXR、PPARδ/RXR和PPARγ/RXR异二聚体可与ADRP PPRE结合。未标记的PPRE寡核苷酸或非特异性DNA用于指示的摩尔过量，以执行竞争分析。ADRP PPRE（M1）5′半位点的点突变取消了PPARδ/RXR异二聚体的结合。(B类)PPARδ/RXR异二聚体对ADRP启动子起反作用。用ADRP报告体（0.1μg）和CMX-PPARδ/CMX-RXR表达载体（10 ng）共同转染RAW 264.7细胞，如*材料和方法*在收集报告基因分析之前，用配体（2μM cPGI、0.1μM LG 268、2μM c PGI+0.1μM LG268和VLDL（25 mg/ml）/LPL（10 mg/ml）处理转染细胞24 h。(C类)ADRP PPRE是一个功能性PPARδ响应元件。三个ADRP或AOx PPRE拷贝被克隆到TK-核糖核酸酶报告基因上游。CV-1细胞与报告者和受体表达载体共转染，并分析荧光素酶活性，如B类. (天)内源性PPARδ和VLDL对ADRP启动子起反作用。瞬时转染实验在*PPARα*^−/−和*PPARδ*^−/−具有含有ADRP基因近端启动子（2065bp）的荧光素酶报告基因构建体的MEFs。

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