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。2003年1月；77(2):1501-11.
doi:10.1128/jvi.77.2.1501-1511.2003。

基于新城疫病毒（NDV）的检测表明NDV蛋白和尼帕病毒V、W和C蛋白具有干扰素拮抗活性

Man-Seong公园 1, 梅根·L·肖, 豪尔赫·穆尼奥斯-约旦, 杰罗姆·F·克罗斯, 中谷隆树, 妮可·鲍维尔, 帕雷斯, 阿道夫·加西亚·萨斯特雷, 克里斯托弗·巴斯勒
附属机构

基于新城疫病毒（NDV）的检测表明NDV蛋白和尼帕病毒V、W和C蛋白具有干扰素拮抗活性

Man-Seong公园等。 J维罗尔。 2003年1月。

摘要

我们已经产生了一种重组新城疫病毒（NDV），该病毒在感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）中表达绿色荧光蛋白（GFP）。该病毒对干扰素（IFN）敏感，用鸡α/βIFN（IFN-α/β）预处理细胞可完全阻断病毒GFP的表达。质粒DNA的预先转染在CEF中诱导IFN反应并阻断NDV-GFP复制。然而，转染已知的干扰素-α/β系统抑制剂，包括甲型流感病毒NS1蛋白和埃博拉病毒VP35蛋白，可以恢复NDV-GFP的复制。因此，我们得出结论，NDV-GFP病毒可用于筛选质粒表达的蛋白质，以抵抗宿主细胞IFN反应。使用该系统，我们发现NDV V蛋白或Nipah病毒V、W或C蛋白的表达可以在面对转染诱导的IFN应答时挽救NDV-GFP复制。尼帕病毒是一种对人类具有高度致死性的病原体，其V和W蛋白也阻断了灵长类细胞中IFN诱导启动子的激活。有趣的是，尼帕病毒V蛋白的氨基末端区域与尼帕病毒W的氨基末端相同，足以发挥干扰素拮抗活性。相反，NDV V蛋白的抗干扰素活性似乎位于该蛋白的羧基末端区域，该区域与腮腺炎病毒和人类副流感病毒2型的V蛋白所显示的干扰素拮抗活性有关。

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数字

图1。
图1。
表达GFP的NDV的构建和生长。（A） NDV-GFP病毒基因组图。（B） 重组NDV Hitchner B1和NDV-GFP病毒在CEF中的生长比较（MOI=0.001）。
图2。
图2。
用质粒DNA转染CEFs诱导IFN-α/β的产生并抑制NDV-GFP的复制。CEF未经处理（A），用鸡IFN-α/β以500 U（B）或1000 U（C）/ml处理，或用空表达质粒pCAGGS（D）转染。在没有（A到C）或（E和F）鸡干扰素中和抗体的情况下进行干扰素治疗。在没有抗干扰素抗体（D）的情况下用空载体转染细胞，或者在转染后立即添加抗体（G）。在处理后20小时或转染后20小时，细胞以1的MOI感染NDV-GFP，然后在感染后24小时检测绿色荧光。
图3。
图3。
流感病毒NS1或埃博拉病毒VP35蛋白的表达可防止质粒转染诱导的NDV-GFP复制抑制。（A） 感染NDV-GFP的细胞在感染各种质粒前24小时转染GFP表达。细胞被模拟转染，转染空的pCAGGS或pcDNA3表达质粒，或转染A型流感病毒NS1蛋白或埃博拉病毒VP35蛋白的表达质粒。（B） 转染指定质粒（pCAGGS、pCAGGS-NS1或pcDNA3-VP35）并随后感染NDV-GFP的CEF的平均相对绿色荧光强度。该图显示了10的绿色荧光的平均相对强度4由FACS测定每个培养物中的细胞。A组和B组的结果来自同一个实验，代表了所示质粒的典型结果。（C） NS1在绿色荧光细胞中的表达。用NS1表达质粒转染CEF，转染24 h后感染NDV-GFP。在感染后24小时，将细胞固定、透化，并用抗甲型流感病毒NS1蛋白的兔抗血清染色。然后进行FACS分析以检测两种NS1(年轴）和GFP(x个轴）。
图4。
图4。
NDV V蛋白的表达可防止转染诱导的NDV-GFP复制抑制。（A） 所用的四个NDV P和V结构图。左侧的灰色框表示共享的氨基末端结构域。V蛋白具有与P蛋白不同的富含半胱氨酸的羧基末端区域。这种V特异性结构域是由于插入一个非模板编码的G残基而产生的，并由阴影框表示。V（V）N个只具有共享的氨基末端区域。V（V）C类具有已添加引发剂ATG的V羧基末端。（B） 感染NDV P、NDV V和NDV V前24 h转染NDV-GFP感染细胞中GFP的表达N个，或NDV VC类表达质粒。（C） 转染空载体（pCAGGS）或转染NDV P、NDV V、NDV V的CEF的相对平均绿色荧光N个，或NDV VC类表达质粒，随后感染NDV-GFP。所示为10的绿色荧光相对平均强度4由FACS测定每个培养物中的细胞。面板B和面板C的结果来自同一个实验，代表了所示质粒的典型结果。
图5：。
图5：。
（A） 使用的五种Nipah P、V和W结构的示意图。阴影框表示共享的氨基末端结构域。V蛋白具有与P蛋白不同的富含半胱氨酸的羧基末端区域。这种V特异性结构域是由于插入一个非模板编码的G残基而产生的，并由实心框表示。W蛋白具有不同于P和V蛋白的羧基末端区域。这个W特异性结构域是由于插入了两个非模板编码的G残基而产生的，并由带有水平线的方框表示。V（V）N个只具有共享的氨基末端区域。V（V）C类具有V羧基末端，其中添加了引发剂ATG。C ORF由阴影框指示。因为C ORF开始时的ATG在V、W和V中发生突变N个构造时，这些构造中的C ORF由打开的框指示。（B） NDV-GFP感染细胞中GFP的表达，在感染前24小时，用空pCAGGS质粒或Nipah病毒V（Nip V）表达质粒模拟转染或转染N个)尼帕病毒V（Nip V）的氨基末端结构域N个)，V（Nip V）的羧基末端结构域C类)，或尼帕病毒W（Nip W）。（C） 转染空载体（pCAGGS）或转染编码Nip V、Nip V质粒的CEF的相对平均绿色荧光N个，Nip V型C类或Nip W。这些质粒的工程目的是不表达C蛋白[用（−C）表示]。所示为10的绿色荧光相对平均强度4由FACS测定每个培养物中的细胞。（D） NDV-GFP感染细胞中GFP的表达，在感染前24小时，用空的pCAGGS质粒或流感病毒NS1或尼帕病毒C蛋白的表达质粒进行模拟转染或转染。（E） 用空载体（pCAGGS）转染或用编码流感病毒NS1或尼帕病毒C的质粒转染的CEF的相对平均绿色荧光4由FACS测定每个培养物中的细胞。面板B和面板C的结果来自同一个实验，面板D和面板E的结果来自相同的实验，代表了所示质粒的典型结果。
图5：。
图5：。
（A） 使用的五种Nipah P、V和W结构的示意图。阴影框表示共享的氨基末端结构域。V蛋白具有与P蛋白不同的富含半胱氨酸的羧基末端区域。这种V特异性结构域是由于插入一个非模板编码的G残基而产生的，并由实心框表示。W蛋白具有不同于P和V蛋白的羧基末端区域。这个W特异性结构域是由于插入了两个非模板编码的G残基而产生的，并且由带有水平线的框表示。V（V）N个只具有共享的氨基末端区域。V（V）C类具有V羧基末端，其中添加了引发剂ATG。C ORF由阴影框指示。因为C ORF开始时的ATG在V、W和V中发生突变N个构建体，这些构建体中的C ORF由开框表示。（B） NDV-GFP感染细胞中GFP的表达，在感染前24小时，用空pCAGGS质粒或Nipah病毒V（Nip V）表达质粒模拟转染或转染N个)尼帕病毒V（Nip V）的氨基末端结构域N个)，V（Nip V）的羧基末端结构域C类)或尼帕病毒W（Nip W）。（C） 转染空载体（pCAGGS）或转染编码Nip V、Nip V质粒的CEF的相对平均绿色荧光N个，Nip V型C类或Nip W。这些质粒的工程目的是不表达C蛋白[用（−C）表示]。所示为10的绿色荧光相对平均强度4由FACS测定每个培养物中的细胞。（D） NDV-GFP感染细胞中GFP的表达，在感染前24小时，用空的pCAGGS质粒或流感病毒NS1或尼帕病毒C蛋白的表达质粒进行模拟转染或转染。（E） 用空载体（pCAGGS）转染或用编码流感病毒NS1或尼帕病毒C的质粒转染的CEF的相对平均绿色荧光4由FACS测定每个培养物中的细胞。面板B和面板C的结果来自同一个实验，面板D和面板E的结果来自相同的实验，代表了所示质粒的典型结果。
图5：。
图5：。
（A） 使用的五个Nipah P、V和W构造的示意图。阴影框表示共享的氨基末端结构域。V蛋白具有与P蛋白不同的富含半胱氨酸的羧基末端区域。这种V特异性结构域是由于插入一个非模板编码的G残基而产生的，并由实心框表示。W蛋白具有不同于P和V蛋白的羧基末端区域。这个W特异性结构域是由于插入了两个非模板编码的G残基而产生的，并由带有水平线的方框表示。V（V）N个只具有共享的氨基末端区域。V（V）C类具有V羧基末端，其中添加了引发剂ATG。C ORF由阴影框指示。因为C ORF开始时的ATG在V、W和V中发生突变N个构造时，这些构造中的C ORF由打开的框指示。（B） NDV-GFP感染细胞中GFP的表达，在感染前24小时，用空pCAGGS质粒或Nipah病毒V（Nip V）表达质粒模拟转染或转染N个)尼帕病毒V（Nip V）的氨基末端结构域N个)，V（Nip V）的羧基末端结构域C类)或尼帕病毒W（Nip W）。（C） 转染空载体（pCAGGS）或转染编码Nip V、Nip V质粒的CEF的相对平均绿色荧光N个，Nip V型C类，或Nip W。这些质粒经过改造，不表达C蛋白[用（−C）表示]。所示为10的绿色荧光相对平均强度4由FACS测定每个培养物中的细胞。（D） NDV-GFP感染细胞中GFP的表达，在感染前24小时，用空的pCAGGS质粒或流感病毒NS1或尼帕病毒C蛋白的表达质粒进行模拟转染或转染。（E） 用空载体（pCAGGS）转染或用编码流感病毒NS1或尼帕病毒C的质粒转染的CEF的相对平均绿色荧光4通过FACS测定的来自每种培养物的细胞。面板B和面板C的结果来自同一个实验，面板D和面板E的结果来自相同的实验，代表了所示质粒的典型结果。
图5：。
图5：。
（A） 使用的五种Nipah P、V和W结构的示意图。阴影框表示共享的氨基末端结构域。V蛋白具有与P蛋白不同的富含半胱氨酸的羧基末端区域。这种V特异性结构域是由于插入一个非模板编码的G残基而产生的，并由实心框表示。W蛋白具有不同于P和V蛋白的羧基末端区域。这个W特异性结构域是由于插入了两个非模板编码的G残基而产生的，并由带有水平线的方框表示。V（V）N个只具有共享的氨基末端区域。V（V）C类具有V羧基末端，其中添加了引发剂ATG。C ORF由阴影框指示。因为C ORF开始时的ATG在V、W和V中发生突变N个构造时，这些构造中的C ORF由打开的框指示。（B） NDV-GFP感染细胞中GFP的表达，在感染前24小时，用空pCAGGS质粒或Nipah病毒V（Nip V）表达质粒模拟转染或转染N个)，尼帕病毒V（Nip V）的氨基末端结构域N个)，V（Nip V）的羧基末端结构域C类)或尼帕病毒W（Nip W）。（C） 转染空载体（pCAGGS）或转染编码Nip V、Nip V质粒的CEF的相对平均绿色荧光N个，Nip V型C类或Nip W。这些质粒的工程目的是不表达C蛋白[用（−C）表示]。所示为10的绿色荧光相对平均强度4由FACS测定每个培养物中的细胞。（D） NDV-GFP感染细胞中GFP的表达，在感染前24小时，用空的pCAGGS质粒或流感病毒NS1或尼帕病毒C蛋白的表达质粒进行模拟转染或转染。（E） 用空载体（pCAGGS）转染或用编码流感病毒NS1或尼帕病毒C的质粒转染的CEF的相对平均绿色荧光4由FACS测定每个培养物中的细胞。面板B和面板C的结果来自同一个实验，面板D和面板E的结果来自相同的实验，代表了所示质粒的典型结果。
图5：。
图5：。
（A） 使用的五种Nipah P、V和W结构的示意图。阴影框表示共享的氨基末端结构域。V蛋白具有与P蛋白不同的富含半胱氨酸的羧基末端区域。该V特异性结构域是由于插入单个非模板编码的G残基而产生的，并且由实心框表示。W蛋白具有不同于P和V蛋白的羧基末端区域。这个W特异性结构域是由于插入了两个非模板编码的G残基而产生的，并由带有水平线的方框表示。V（V）N个只具有共享的氨基末端区域。V（V）C类具有V羧基末端，其中添加了引发剂ATG。C ORF由阴影框表示。因为C ORF开始时的ATG在V、W和V中发生突变N个构造时，这些构造中的C ORF由打开的框指示。（B） NDV-GFP感染细胞中GFP的表达，在感染前24小时，用空pCAGGS质粒或Nipah病毒V（Nip V）表达质粒模拟转染或转染N个)尼帕病毒V（Nip V）的氨基末端结构域N个)，V（Nip V）的羧基末端结构域C类)或尼帕病毒W（Nip W）。（C） 转染空载体（pCAGGS）或转染编码Nip V、Nip V质粒的CEF的相对平均绿色荧光N个，Nip V型C类或Nip W。这些质粒的工程目的是不表达C蛋白[用（−C）表示]。所示为10的绿色荧光相对平均强度4由FACS测定每个培养物中的细胞。（D） NDV-GFP感染细胞中GFP的表达，在感染前24小时，用空的pCAGGS质粒或流感病毒NS1或尼帕病毒C蛋白的表达质粒进行模拟转染或转染。（E） 用空载体（pCAGGS）转染或用编码流感病毒NS1或尼帕病毒C的质粒转染的CEF的相对平均绿色荧光4由FACS测定每个培养物中的细胞。面板B和面板C的结果来自同一个实验，面板D和面板E的结果来自相同的实验，代表了所示质粒的典型结果。
图6。
图6。
尼帕病毒蛋白在Vero细胞中抑制干扰素诱导的ISRE启动子激活。尼帕病毒V、W和V截短突变表达质粒对干扰素β诱导的干扰素诱导启动子激活的影响。用所示质粒转染Vero细胞，模拟处理（−IFN）或用人IFN-β（+IFN）处理。表达质粒编码尼帕病毒V（Nip V）、尼帕病毒W（Nip W）、尼巴病毒V和W共同的氨基末端区域（Nip Vn）或尼帕病毒V特异性的羧基末端区域（Nip Vc）。图中所示为干扰素诱导的CAT报告基因在干扰素引导的HISG54启动子的控制下的相对活性，该启动子归一化为由组成性表达的雷尼利亚荧光素酶表达质粒。转染后1天用1000 U人干扰素β/ml处理细胞，1天后进行CAT和荧光素酶分析。
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