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。2003年3月7日；278(10):8780-5.
doi:10.1074/jbc。M208120200。 Epub 2002年12月23日。

与Holt-Oram综合征相关的TBX5错义突变的功能分析

春帆 1, 刘木根, 王庆（音）
附属公司

与Holt-Oram综合征相关的TBX5错义突变的功能分析

春帆等。 生物化学杂志。 。

摘要

TBX5是一种在器官发生中起关键作用的T盒转录因子。在以先天性心脏缺陷和上肢畸形为特征的Holt-Oram综合征患者中，已发现TBX5中的七个错义突变。然而，这些突变的功能意义和分子致病机制尚不清楚。在本研究中，我们描述了具有这些错义突变（Q49K、I54T、G80R、G169R、R237Q、R237 W和S252I）的突变TBX5的DNA结合、转录活性、蛋白质相互作用和细胞定位方面的功能缺陷。突变G80R、R237Q和R237W代表一组突变，显著降低TBX5的DNA结合活性，导致TBX5转录激活降低，TBX5和NKX2.5之间的转录激活失去协同作用。第二组突变包括Q49K、I54T、G169R和S252I，它们对TBX5的DNA结合活性和转录激活功能没有或中等影响，但导致TBX5和NKX2.5之间的协同转录活性完全丧失。所有七个错义突变都大大降低了TBX5与NKX2.5在体内和体外的相互作用。免疫荧光染色显示野生型TBX5完全定位于细胞核，但突变体定位于细胞核和细胞质。这些结果表明，这里研究的所有七个错义突变都是功能性突变，其缺陷范围从DNA结合活性和转录激活的降低到TBX5和NKX2.5之间相互作用的显著降低，以及这两个蛋白之间转录激活的协同作用的丧失，以及TBX5核定位受损。这些缺陷可能是Holt-Oram综合征发病机制的核心。

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数字

图1
图1。Holt-Oram综合征患者中发现的TBX5错义突变
在20多个TBX5突变中，Q49K、I54T、G80R、G169R、R237Q、R237 W和S252I代表Holt-Oram综合征患者中发现的错义突变。TBX5由9个外显子组成，外显子3-7编码负责DNA结合的T结构域。注意，N端有两个突变（Q49K和I54T），T盒结构域中有四个突变（G80R、G169R、R237Q和R237W），C端有一个突变（S252I）。
图2
图2。TBX5错义突变对DNA结合活性的影响
合成了野生型和突变型TBX5蛋白在体外使用TNT耦合转录/翻译系统。TBX5-binding位点是一个合成的双链DNA片段，对应于ANF公司转录起始位点（5′-aataTCACACCTgtac-3′）。A类，EMSA。车道“−”，无TBX5蛋白；重量，野生型TBX5；问题49K,I54吨,G80R型,G169R（G169R）,237Q兰特,237瓦、和S252I型，TBX5具有个别错感突变。B类一种银染蛋白凝胶，显示EMSA中使用的野生型和各种突变TBX5蛋白的合成水平大致相同。车道1，无TBX5表达质粒DNA；车道2，野生型TBX5；3–9车道分别代表Q49K、I54T、G80R、G169R、R237Q、R237 W和S252I突变型TBX5。C类EMSA含有不同数量的野生型TBX5和突变体G80R和R237Q。D类，中TBX5-DNA复合物的量面板C绘制TBX5浓度图。野生型TBX5特定绑定的拟合斜率(重量)突变体G80R和R237Q分别为79.5、19.5和11.7。
图3
图3。有无NKX2.5时TBX5错义突变对转录激活活性的影响
A类，报告基因用于转录激活分析。启动子区域，从转录起始位点上游−270到+1 bpANF公司融合到荧光素酶基因(LUC公司)。B类，TBX5缺失时所有七个错义突变的转录激活分析(左侧块)和存在(右挡块)NKX2.5。转录活性显示为年-轴。仅载体的转录活性被任意设置为1。重量，野生型。注意，TBX5的所有错义突变都消除了ANF公司TBX5和NKX2.5之间的启动子。C类Western blot分析以确定突变TBX5是否在转染COS-7细胞中成功表达。比利时，从细菌过表达系统中纯化野生型TBX5对照；重量，含有表达的FLAG标记野生型TBX5的COS-7细胞裂解物的lane；问题49K,I54吨,G80R型,G169R（G169R）,237Q兰特,237瓦、和S252I型，含有COS-7细胞裂解产物的通道，其中含有表达的TBX5蛋白和相应的突变。
图4
图4。TBX5错义突变对TBX5与NKX2.5相互作用的影响体内(A类)和在体外(B类)
A类用His-TBX5和NKX2.5-HA表达质粒瞬时转染HeLa细胞。含有His标记的TBX5和/或HA-标记的NKX2.5的总细胞裂解物与Ni-NTA珠培养，用12%SDS-PAGE分离，并用抗-His抗体进行Western blot分析(上部面板)或用抗HA单克隆抗体(中间面板). 与Ni-NTA微球结合的蛋白质用洗涤缓冲液洗涤，洗脱，并用12%SDS-PAGE进行分离，然后用抗鼠HA对NKX2.5进行Western blot分析。车道1，野生型(重量)TBX5未联合转染NKX2.5；车道2，野生型TBX5，与NKX2.5共转染；车道2–9、TBX5分别与NKX2.5-HA联合转染Q49K、I54T、G80R、G169R、R237Q、R237 W和S252I。B类、GST-NKX2.5融合蛋白和在体外-翻译的His标记TBX5与谷胱甘肽-脑葡萄糖4B珠培养，与珠结合的蛋白质用PBS洗涤，洗脱，用12%SDS-PAGE分离，并用抗His抗体进行Western blot分析以检测TBX5。GST下拉分析中使用了大约等量的野生型和各种突变TBX5蛋白，如图2图例所示B类。
图5
图5。表达人TBX5的NIH-3T3细胞的免疫染色
A类,重量，用FLAG标记的野生型TBX5构建物转染细胞；问题49K,I54吨,G80R型,237Q兰特,237瓦,g169转、和第252页代表过度表达各种突变TBX5蛋白的细胞。转染细胞用抗FLAG免疫染色(绿色)TBX5，细胞核用DAPI染色(蓝色). 在未转染的细胞中未观察到可检测的免疫荧光染色。注意，野生型TBX5完全定位于细胞核，而具有各种错义突变的TBX5蛋白分布于细胞核和细胞质中。B类,核百分比与野生型TBX5的细胞质分布(重量)和突变型(问题49K,I54吨,G80R型,G169R（G169R）,237Q兰特,237瓦、和S252I型). 数据基于面板A。
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