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.2002年12月16日；21(24):6801-10.
doi:10.1093/emboj/cdf683。

HIV-1 Tat以微管为靶点诱导凋亡，这是一个由促凋亡Bcl-2相关Bim促进的过程

陈丹（Dan Chen） 1, 迈克尔·王, Sharleen Zhou（周莎琳）, Qiang Zhou（周强）
附属公司

HIV-1 Tat以微管为靶点诱导凋亡，这是一个由促凋亡Bcl-2相关Bim促进的过程

陈丹（Dan Chen）等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

CD4（+）T细胞耗竭是HIV感染和艾滋病进展的标志。除了直接杀死病毒感染的细胞外，HIV感染还导致主要未感染的旁观者细胞的凋亡增加。这部分是通过HIV-1 Tat蛋白介导的，该蛋白由感染细胞分泌，并被未感染细胞吸收。利用亲和纯化方法，检测到Tat与微管蛋白和聚合微管的特异性直接相互作用。这种相互作用并不影响Tat的分泌和摄取，但对Tat诱导细胞凋亡至关重要。Tat通过其保守核心区的一个四氨基酸亚结构域结合微管蛋白/微管，导致微管动力学的改变和线粒体依赖性凋亡途径的激活。Bim是一种促凋亡的Bcl-2相关基因，是由微管动力学扰动引发的死亡信号的传感器，促进Tat诱导的细胞凋亡。我们的发现揭示了Tat通过靶向微管网络诱导细胞凋亡的策略。因此，HIV-1 Tat加入了越来越多靶向宿主细胞细胞骨架的病原衍生蛋白的行列。

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图1。Tat与细胞质中αβ-微管蛋白二聚体和聚合微管的直接和特异性相互作用。(一个)亲和纯化Tat–HA–Flag与αβ-微管蛋白二聚体结合。用空载体或表达Tat–HA–Flag的载体转染293T细胞的全细胞裂解物，用抗Flag和抗HA亲和珠进行两轮免疫沉淀。最后用HA肽洗脱后，通过SDS-PAGE和银染分析Tat–HA–Flag及其相关因子（α-HA和α-Flag IP）。非特定带用星号表示。从凝胶中回收特定的50 kDa Tat相关带，并用胰蛋白酶消化。对胰蛋白酶肽进行微序列分析，确定其为α-和β-微管蛋白的混合物。(B类)微管蛋白二聚体与亲和纯化的Tat–HA–Flag的关联通过α-微管蛋白特异性抗体的western blotting证实。(C类)GST下拉分析揭示了固定化GST–Tat和纯化的αβ-微管蛋白二聚体之间的直接相互作用。GST–RBP3和GST单独用作对照。通过抗α-微管蛋白蛋白质印迹分析与珠子相关的微管蛋白二聚体。(D类)Tat也与聚合微管相互作用。用空载体或表达Tat–Flag的构建体转染的293T细胞的清除裂解物与（+）或不与（-）紫杉醇一起孵育，然后如所述进行超速离心（Puthalakath等., 1999). western blotting法测定颗粒（P）和上清液（S）中微管/微管蛋白、Tat–Flag和转录因子Cdk9的水平。Cdk9起到了内部控制作用，在（+）和（-）紫杉醇条件下，如预期的那样留在上清液中。(E类)Tat-微管蛋白相互作用发生在细胞质中。从转染Tat–Flag表达结构的293T细胞制备细胞质和核提取物，并进行抗Flag免疫沉淀。通过western blotting分析沉淀物中是否存在α-微管蛋白和Tat–Flag。
无
图2。Tat通过其保守核心区域内的一个四氨基酸亚结构域结合微管蛋白。(一个)野生型Tat、N-或C-末端截断Tat和丙氨酸（A）替代Tat突变体的结构域。这些Tat蛋白与αβ-微管蛋白二聚体结合的能力在体外在右边的列中进行了总结。在各种慢病毒Tat蛋白中高度保守的核心区域（氨基酸36–48）显示为Tat中间的一个暗盒。(B类)GST下拉分析确定Tat中的四氨基酸微管蛋白结合亚结构域。将一组含有野生型和各种Tat突变体的固定化GST–Tat融合蛋白调整到相同水平（1µg），并在前述条件下检查其与纯化的αβ-微管蛋白二聚体（1μg）的相互作用（Chen等人，1999年）。在广泛清洗后，通过western blotting检测到Tat相关微管蛋白。(C类)Tat的四氨基酸亚结构域对Tat–微管蛋白结合也至关重要体内将转染有所示Tat结构体的293T细胞的全细胞裂解物进行抗Flag免疫沉淀，并通过western blotting分析沉淀中是否存在α-微管蛋白和各种Tat–Flag蛋白。(D类)Tat–微管蛋白相互作用发生在逆转录病毒感染的Jurkat T细胞中。在MuLV LTR的驱动下，在感染条件下从pBabe-puro逆转录病毒载体表达WT Tat–Flag和Tat（36–39）A-Flag。空载体（pBabe-puro）提供了阴性对照。对感染细胞中清除的裂解物进行抗Flag免疫沉淀，并通过western blotting分析沉淀物中是否存在Tat–Flag及其相关微管蛋白。
无
图3。Tat诱导的凋亡需要Tat的微管蛋白结合域，而G则不需要1延迟。(一个)Tat中微管蛋白结合域的突变不影响Tat的释放和细胞质摄取。转染后24小时，将表达Flag标记野生型Tat、Tat（36–39）A、Cdk9或cyclin T1的转染293T细胞与未转染细胞按1:1混合。1天后，用抗Flag免疫荧光染色对共培养细胞进行分析。参考Hoechst 3342生成的核DNA染色模式。(B类)Tat诱导的凋亡需要Tat的微管蛋白结合活性。将重组野生型Tat和指示的Tat突变体以两种不同浓度添加到Jurkat细胞培养物中，并通过流式细胞术分析具有亚二倍体细胞核的凋亡细胞的百分比，并在柱形图中汇总。(C类)微管蛋白结合中Tat活性的持续表达抑制293T细胞的集落形成。表达所示Tat蛋白的构建物与pBabe-Puro以30:1的比例联合转染293T细胞，获得对嘌呤霉素的耐药性。转染Tat蛋白的表达水平相似（数据未显示）。培养2周后计算耐嘌呤霉素菌落的数量并绘制曲线。(D类)Jurkat细胞的Tat处理导致PARP的切割。将3.75µg/ml的重组野生型Tat和突变型Tat（36-39）A加入Jurkat细胞的培养物中。18小时后制备全细胞裂解物，并通过抗PARP蛋白质印迹进行分析。(E类)Tat可独立于其微管蛋白结合活性阻止视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）的磷酸化。用野生型Tat或Tat（36–39）A处理Jurkat细胞的全细胞裂解物，通过western blotting（Kundu）分析磷酸化（ppRb）和低磷酸化（pRb）视网膜母细胞瘤蛋白的存在等.，1998年）。(F类)逆转录病毒感染条件下野生型Tat而非Tat（36–39）A的表达会导致细胞凋亡。野生型Tat或Tat（36–39）A与GFP从含有IRES的逆转录病毒载体共同产生。通过流式细胞术对感染的GFP阳性Jurkat细胞进行门控，并通过摄取碘化丙啶测定细胞死亡百分比。在感染细胞中检测到野生型和突变型Tat的类似表达水平（数据未显示）。仅表达GFP的病毒被用作对照。
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图4。Tat通过阻止微管解聚诱导细胞凋亡。(一个)Tat处理Jurkat细胞可以稳定微管，并且这种作用先于半胱天冬酶的激活。用所示试剂处理Jurkat细胞后，将一半细胞在SDS–PAGE样品缓冲液中煮沸，以获得细胞中总微管蛋白和微管的混合物（T）。另一半用含有0.5%Triton X-100的缓冲液提取，并进行离心，以获得含有组装微管的颗粒（P）和含有所述游离微管二聚体的上清液（S）（Nguyen等., 1999). 通过抗α-微管蛋白免疫印迹分析每个组分中微管蛋白/微管的数量。在平行实验中，如图3A所示，通过流式细胞术测定各种药物诱导的细胞凋亡，并在western blot下显示凋亡百分比。(B类)Tat处理后细胞微管网络的改变。用指示的试剂处理NIH 3T3细胞，并使用α-微管蛋白抗体通过免疫荧光染色进行分析，以可视化微管网络。
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图5。Tat通过线粒体途径诱导细胞凋亡。(一个)Tat处理Jurkat细胞可导致procaspase-9的高效裂解。采用抗蛋白酶9蛋白印迹法检测经上述药物处理的Jurkat细胞全细胞裂解液中的procaspase-9和裂解caspase-8。(B类)显性阴性FADD抑制死亡受体通路并不能阻止Tat诱导的凋亡。小鼠A20细胞以及稳定表达显性阴性FADD的A20衍生物用指定的凋亡诱导剂处理。通过流式细胞术测定细胞凋亡率，显示的数据代表了四个独立实验。(C类)比姆L（左）敏化Tat诱导的细胞凋亡。稳定表达Bcl-2或Bcl-2加Bim的小鼠FDC-P1细胞L（左）用指定的凋亡诱导剂进行治疗。通过流式细胞术测定细胞凋亡率，所示数据代表三个独立实验。(D类)缺乏Bim的T淋巴细胞比野生型细胞更能抵抗Tat诱导的凋亡。从野生型和Bim的脾脏和淋巴结中纯化T细胞–/–敲除小鼠，并用不同量的Tat处理，如图所示。培养12小时后，用碘化丙啶对T细胞进行染色，并通过流式细胞术测定细胞死亡。
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