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.2003年1月；77(1):460-9.
doi:10.1128/jvi.77.1.460-469.2003。

蛋白激酶CβII在流感病毒通过晚期内体进入中的作用

萨拉·西奇卡尔斯基（Sara B Sieczkarski） 1, H亚历克斯·布朗, 加里·惠塔克
附属公司

蛋白激酶CβII在流感病毒通过晚期内体进入中的作用

萨拉·西奇卡尔斯基（Sara B Sieczkarski）等。 J维罗尔. 2003年1月.

摘要

许多病毒利用受体介导的内吞作用进入靶细胞。我们利用流感病毒和Semliki Forest病毒（SFV）来确定蛋白激酶CβII（PKCbetaII）在内吞贩运中的作用。我们表明，特异性PKC抑制剂可预防流感病毒感染，这表明PKC的经典亚型具有作用。我们还检测了过度表达显性阴性形式PKCalpha和β的细胞中的病毒进入。表达磷酸化缺陷形式的PKCβII（T500V），但不是等效的PKCα突变形式的细胞，抑制了流感病毒的成功进入，病毒在晚期内体中积累。然而，据信SFV从早期内体进入细胞，不受PKCbetaII T500V表达的影响。我们还检测了两种细胞配体的贩运，即转铁蛋白和表皮生长因子（EGF）。PKCbetaII T500V表达特异性阻断EGF受体的运输和降解，而不影响转铁蛋白受体的循环。与流感病毒一样，在PKCbetaII激酶死亡细胞中，EGF受体被困在晚期的内体室中。我们的研究结果表明，PKCbetaII是流感病毒进入和感染所需的晚期内体分选事件的重要调节器。

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数字

图1。
图1。
PKC抑制剂Gö6976可防止流感病毒进入。抑制剂处理细胞的免疫荧光分析。HeLa细胞在20μM Gö6976（a）存在下以低感染倍数感染4小时或不治疗（b）。用单克隆NP抗体检测流感感染。棒材=5μm。
图2。
图2。
磷酸化缺陷的PKCβII而非PKCα的表达可阻止流感病毒进入。（A） HeLa细胞在高倍数感染前瞬时转染野生型和磷酸化缺陷型T500V PKCβII 60分钟。（B）Mv1 Lu、CHO、BHK和极化MDCK细胞在高倍数感染前瞬间转染PKCβⅡT500V质粒60分钟HeLa细胞在感染前以高感染倍数瞬时转染野生型或磷酸化缺陷型（K368R）PKCα质粒60分钟。对照细胞未在感染前转染。使用多克隆NP抗体通过间接免疫荧光检测流感病毒信号。使用针对PKCβ或FLAG表位的单克隆抗体检测表达。棒材=5μm。
图3。
图3。
PKCβII T500V的表达不抑制SFV感染。感染前，将PKCβII野生型或T500V质粒瞬时转染HeLa细胞16 h。用SFV（a和b）或流感病毒（c和d）以低倍数感染细胞5小时。用单克隆抗SFV E1-1抗体或抗流感病毒NP抗体检测病毒信号。用抗PKCβ的单克隆抗体检测PKCβII的表达。棒材=5μm。
图4。
图4。
流感vRNPs在缺乏PKCβII活性的细胞中的晚期内体中积累。将PKCβII野生型或T500V质粒瞬时转染HeLa细胞16 h，然后进行高倍性感染60 min。（a）采用间接免疫荧光研究分析流感病毒和细胞囊泡的表达模式。使用多克隆NP抗体确定流感病毒的定位。EEA1（早期内体的标记）、M6PR和CD63/Lamp3（晚期内体的标志）以及高尔基体分别使用各自的单克隆抗体进行定位。（B） 共聚焦显微镜研究用于分析流感病毒和晚期内吞囊泡的表达模式。流感定位由多克隆NP抗体确定，晚期内体用CD63/Lamp3单克隆抗体定位。棒材=5μm。
图5：。
图5：。
PKCβII T500V的表达不会影响病毒进入所需的内体酸化。（A） HeLa细胞瞬时转染PKCβII野生型或T500V质粒16小时，然后进行高倍性感染60分钟。然后用10μM尼葛霉素和莫能菌素处理细胞，并在缓冲至pH 7.0或5.5的培养基中用20 mM HEPES培养。在60分钟时固定细胞，使用多克隆NP抗体通过间接免疫荧光检测vRNP。棒材=5μm。（B） 在用X-31流感病毒株进行高多重性感染之前，用PKCβII野生型或T500V质粒瞬时转染HeLa细胞16小时。用构象特异性单克隆抗体N2（中性）和A2（酸性）间接免疫荧光法检测病毒HA糖蛋白。对照组未转染，但用25 nM巴非霉素A处理。棒状物=8μm。
图6。
图6。
EGFR在表达PKCβII T500V的细胞中降解效率较低。（A） 用野生型或激酶死亡（T500V）PKCβII质粒瞬时转染HeLa细胞16 h。然后将细胞在37°C下血清饥饿24 h。将EGF在4°C下结合60分钟，清洗细胞，然后在37°C下培养指定时间。用抗EGFR单克隆抗体间接免疫荧光法检测EGFR。棒材=8μm。（B） 用PKCβII T500V质粒瞬时转染HeLa细胞16 h或模拟转染HeLa细胞。细胞被血清饥饿，在1小时（蓝色痕迹）和3小时（红色痕迹）进行EGF摄取分析。使用抗EGFR的单克隆抗体制备细胞用于流式细胞术。（C） 瞬时转染激酶缺失（T500V）PKCβII、激酶缺失PKCα（K368R）或显性阴性PKCλMUT公司)质粒转染16h或未转染。对细胞进行血清饥饿处理，并按照B组所述进行EGF摄取分析。使用抗EGFR的单克隆抗体制备细胞用于流式细胞术。信号强度在1h时间点进行了归一化，EGFR在3h时间点降解的相对量以百分比表示。（D） 将PKCβII T500V质粒瞬时转染HeLa细胞16 h，然后饥饿血清。允许EGF摄取120分钟。共聚焦显微镜研究用于分析EGFR和晚期内吞囊泡的表达模式。使用抗EGFR抗体确定EGFR定位，使用CD63/Lamp3抗体定位晚期内体。棒材=5μm。
图7。
图7。
转铁蛋白受体再循环不受缺乏PKCβII活性的影响。用PKCβII野生型或T500V质粒瞬时转染HeLa细胞16小时。然后在4°C下将Alexa 594标记的转铁蛋白（50μg/ml）与缺血细胞结合20分钟。然后将细胞移到37°C下15分钟，在低H甘氨酸中清洗以去除任何未经修饰的配体，并将其返回37°C 15分钟以监测受体循环。用转铁蛋白受体抗体通过荧光显微镜分析细胞。棒材=8μm。
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