A high-throughput Arabidopsis reverse genetics system

doi:10.1105/tpc.004630

.2002年12月；14(12):2985-94.

doi:10.1105/tpc.004630。

一个高通量拟南芥反向遗传系统

附属公司

PMID： 12468722
预防性维修识别码：项目经理151197
内政部： 10.1105/tpc.004630

一个高通量拟南芥反向遗传系统

艾伦训练等。植物细胞. 2002年12月.

.2002年12月；14(12):2985-94.

doi:10.1105/tpc.004630。

附属

¹美国加利福尼亚州圣地亚哥梅利菲尔德街3115号先正达Torrey Mesa研究所，邮编92121。allen.sessions@syngenta.com

PMID： 12468722
预防性维修识别码：项目经理151197
内政部： 10.1105/tpc.004630

摘要

为了提高功能基因组学的效率，我们收集了拟南芥株系，其中T-DNA插入了已知的位点。开发了一种高通量的改良热不对称交错（TAIL）-PCR方法，用于从大约100000个转化株系中扩增T-DNA左边界两侧的DNA片段。对来自52964个T-DNA系的总共85108个TAIL-PCR产物进行测序，并与拟南芥基因组进行比较，以确定T-DNA在每个系中的位置。预测的T-DNA插入位点在绘制时显示出与预测编码序列的偏差。可以使用拟南芥基因索引名称搜索或BLAST（基本局部对齐搜索工具）搜索来识别感兴趣基因中的预测插入突变。插入可以通过对单个品系进行简单的PCR检测来确认。在340个被测品系中，257个品系证实了预测插入（76%）。该资源被命名为SAIL（先正达拟南芥插入图书馆），可在www.tmri.org上向科学界提供。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
48个品系次级mTAIL-PCR产物的琼脂糖凝胶分析。尺寸标准显示在左侧，带尺寸以kb表示。请注意，对于单个样品，较低分子质量带通常比较大产品的含量相对较大。

**图2。**
一个插入系左边界mTAIL-PCR产物的序列分析。**（A）**使用NCBI BLAST服务器从板1154、井E08上的设备生成的序列BLAST命中方案(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast). 如顶部所示，排名靠前的三个点击是对齐分数的颜色编码。位置32至68与左侧边界T-DNA序列对齐（绿色），位置110至315与拟南芥第5染色体序列对齐，位置338至651与第1染色体序列对齐。**（B）**中序列的电泳图谱区域**（A）**，区域由彩色条表示，如**（A）**注意，5′序列的整体信号强度高于3′序列，并且包含来自额外mTAIL-PCR片段序列的低振幅信号。第二个序列被更高振幅的序列掩盖，直到基数340。

**图3。**
预测插入的染色体分布。转录单位插入显示为褐红色，启动子插入显示为蓝色，基因间插入显示为绿色。每50-kb间隔的插入数绘制为每条染色体两侧的峰值。刻度由虚线表示，虚线表示100次点击的间隔，最大值为250次。峰值大于250的数字表示数值。

**图4。**
使用带有T-DNA左边界和基因特异性正向和反向引物的PCR进行插入确认。基因特异性引物为5′-TTTCACGATCTTAGAC-3′（Gf；正向）和5′-AATACCTGTTGCAAGAG-3′（Gr；反向）。LB3，左边框。**（A）**At4g39030（EDS5/SID1）的方案和第1255_E09行中预测的插入，预计位于第一内含子的841位置。**（B）**对1255_E09系野生型（wt）Columbia（阴性对照）和10个后代植株的预测插入进行PCR分析。使用引物集Gf/Gr和Gr/LB3的PCR产物在每个样品的相邻通道中进行。植物1、3、6、8和10是插入的半合子，而植物4、5和7是插入的纯合子。

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