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.2002年12月1日；22(23):10399-407.
doi:10.1523/JNEUROSCI.22-23-10399.2002。

海马神经元释放天然脑源性神经营养因子活性依赖性的细胞机制

阿格涅斯卡·巴尔科维奇 1, 大卫·M·卡茨
附属公司

海马神经元释放天然脑源性神经营养因子活性依赖性的细胞机制

阿格涅斯卡·巴尔科维奇等。 神经科学. .

摘要

脑源性神经营养因子（BDNF）在神经元连接和突触强度的活动依赖性改变中起着关键作用，包括海马长时程增强（LTP）的建立。为了阐明BDNF依赖性突触可塑性的机制，本研究旨在描述新生大鼠海马神经元释放天然BDNF以响应培养中与生理相关的电场刺激模式，包括5Hz的强直刺激，25和100 Hz的突发刺激，以及θ突发刺激（TBS）。使用我们实验室开发的ELISA原位技术测量释放量，以量化天然BDNF的分泌，而无需首先将蛋白质过度表达到非生理水平。每种刺激方案都导致BDNF释放显著增加，BDNF对河豚毒素敏感，并且在没有谷氨酸受体激活的情况下发生。然而，100 Hz破伤风和TBS是诱导海马LTP最有效的刺激模式，与低频刺激相比，它们在释放天然BDNF方面更有效。在所有测试的刺激方案中，清除细胞外钙或阻断N型钙通道可阻止BDNF的释放。类似地，用thapsigargin耗尽细胞内钙储备，并用丹曲烯（一种咖啡因-氰化物敏感性储备的钙释放抑制剂）处理，显著抑制活性依赖性BDNF的释放。我们的结果表明，BDNF的释放可以编码海马神经元活动的时间特征。通过N型钙通道的钙内流和细胞内储存的钙动员的双重需求强烈暗示了钙诱导的钙释放在活性依赖性BDNF分泌中的作用。

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数字

图1。
图1。
短期模式的电刺激，但不是短期持续的KCl去极化，显著增加了海马神经元天然BDNF的释放。新生海马神经元姐妹培养物3d后BDNF的平均水平在体外加上30分钟以下：（1）控制条件（无刺激；n个=48），（2）TBS（每20秒，在100Hz下以5Hz传送25个突发的4个脉冲；n个=30），或（3）连续去极化50 m米KCl公司(n个= 39). ***第页< 0.001;不另说明。，不显著。
图2。
图2。
与低频刺激相比，已知可诱导LTP的高频电刺激模式在释放海马神经元天然BDNF方面更有效。A类，适用于每组文化的刺激模式示意图。B类，新生海马神经元姊妹培养物在电场刺激30分钟期间释放BDNF的平均水平，电场刺激100个4毫秒的双相矩形脉冲，频率为5赫兹(n个=16），10赫兹(n个=14），25赫兹(n个=40），100赫兹(n个=42），或TBS(n个=30），间歇间隔分别为0、10、16、19和15秒，如所示A类. *第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001;不另说明。，不显著。
图3。
图3。
天然BDNF的活性依赖性释放依赖于动作电位。新生海马神经元姊妹培养物在电场刺激30分钟期间释放的BDNF平均水平[100个4毫秒的双相矩形脉冲，以25 Hz的频率传递(n个=12），100赫兹(n个=10）和TBS(n个=4），每20秒一次](黑色条)或存在(灰色条)1.5μ米TTX是电压依赖性钠通道的抑制剂**第页< 0.01; ***第页< 0.001.
图4。
图4。
通过模式化电刺激诱发的天然BDNF释放不需要谷氨酸能突触活动。A类，新生海马神经元姊妹培养物在电场刺激30分钟期间释放的BDNF平均水平[100个4毫秒的双相矩形脉冲，以25 Hz的频率传递(n个=8），100赫兹(n个=8）和TBS(n个=10），每20秒一次](黑色条)或存在CNQX（20μ米)和APV（100μ米)，分别为非NMDA和NMDA谷氨酸受体的拮抗剂(CNQX-APV公司;灰色条).B类，暴露于100μ米反式-[1S公司,3R（右）]-mGluR I和II激动剂ACPD(t-ACPD（t-ACPD）;n个=12），或在θ-脉冲模式下的电场刺激(TBS（待定）;n个=12）在缺席的情况下(黑色条)或代谢型谷氨酸受体拮抗剂AIDA（500μ米;灰色条)和LY341495（100μ米;白色条); ***第页< 0.001;不另说明。，不显著。
图5。
图5。
通过模式化电刺激诱发的天然BDNF释放需要通过N型电压激活的钙通道进行钙内流。在30分钟的电场刺激过程中，新生海马神经元姐妹培养物中释放的BDNF的平均水平（100个4msec的双相矩形脉冲，以25 Hz、100 Hz和TBS的频率传递，每20秒一次）：A类，在场(控制;黑色条)或缺席(无钙;灰色条)细胞外钙（25 Hz，n个= 6; 100赫兹，n个= 4; TBS（待定），n个= 4);B类，在缺席的情况下(控制;黑色条)或存在1μ米ω-芋螺毒素GVIA，一种N型通道拮抗剂（ω-芋螺毒素;灰色条)（25赫兹，n个= 4; 100赫兹，n个= 10; TBS（待定），n个= 4);C类，在缺席的情况下(控制;黑色条)或存在2μ米尼莫地平，一种L型通道拮抗剂(尼莫地平;灰色条)（25赫兹，n个= 4; 100赫兹，n个= 4; TBS（待定），n个= 6). **第页< 0.01; ***第页< 0.001;不另说明。，不显著。
图6。
图6。
为了响应模式化电刺激而释放天然BDNF，需要从ryanodine敏感性存储库中动员钙。新生儿海马神经元姊妹培养物在30分钟暴露于任一30μ米咖啡因或电场刺激θ-爆发模式(TBS（待定）)在缺席的情况下(黑色条)或存在丹曲烯（50μ米)是一种选择性的ryanodine受体通道拮抗剂。用thapsigargin（10μ米)，选择性抑制内质网钙2+-ATP酶(灰色条);n个= 8. ***第页< 0.001.
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