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.2002年11月15日；16(22):2893-905.
doi:10.1101/gad.1035902。

与含Zeste蛋白增强子的人类多蛋白复合物相关的组蛋白甲基转移酶活性

安德烈·库兹米切夫 1, 西冈贤一, Hediye Erdjument-Bromage公司, 保罗·坦普斯特, 丹尼·雷因伯格
附属公司

与含Zeste蛋白增强子的人类多蛋白复合物相关的组蛋白甲基转移酶活性

安德烈·库兹米切夫等。 基因开发. .

摘要

Zeste增强子[E（z）]是一种多梳组转录阻遏物，是SET结构域蛋白家族的创始成员之一。一些SET域蛋白具有固有的组蛋白甲基转移酶（HMT）活性。然而，在HMT试验中发现重组E（z）蛋白是无效的。在这里，我们报道了一种多蛋白E（z）复合物的分离，该复合物包含额外的性梳、zeste-12抑制剂[Su（z）12]和组蛋白结合蛋白RbAp46/RbAp48。这种复合物，我们称之为Polycomb抑制复合物（PRC）2，具有HMT活性，对组蛋白H3的Lys 9（K9）和Lys 27（K27）具有特异性。PRC2的HMT活性依赖于E（z）蛋白中完整的SET结构域。我们假设E（z）蛋白的转录抑制涉及PRC1的甲基化依赖性招募。在PRC2中存在Su（z）12，这是一种位置效应杂色的强抑制因子，表明PRC2可能在异染色质介导的沉默中发挥广泛作用。

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数字

图1
图1
分离人Flag-ESC复合物。(A类)sephacryl-400柱馏分的Western blot分析。使用抗Flag抗体检测Flag-ESC（F-ESC）。使用针对重组蛋白（Otte博士的礼物）的抗体检测E（z）。E（z）和Flag-ESC用箭头表示。垂直箭头表示分子尺寸标准的洗脱峰。指出了用于反标记免疫亲和性纯化的“复合物”和“单体”池。(B类)免疫亲和纯化的Flag-ESC复合物的Western blot分析。输入表示用于抗病毒免疫纯化的293-TAG细胞提取物复合物池的1/100（10μL）；Flag-ESC表示来自反Flag亲和柱的肽洗脱液的十分之一（10μL）；模拟结果表明，十分之一的肽洗脱液来自一个反标记亲和柱，该柱用于从未标记的细胞提取物中纯化复合物池。IP，免疫沉淀；α-标记，抗标记抗体。(C类)含有抗旗帜柱肽洗脱液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的银染色。通过sephacryl-400柱从293和TAG-293核提取物中衍生出复合物和单体池。显示了特定于Flag-ESC复合体的带。点表示污染带，也存在于未标记细胞提取物的免疫沉淀物中（293）。并指出了分子尺寸标准的地位。(D类)瞬时转染Flag-GFP（阴性对照）或Flag-Su（z）12的293细胞的抗Flag免疫沉淀物的Western blot。输入表示用于免疫沉淀的核提取物的1/100（～10μg）；α-标记通道，一半肽洗脱液部分来自反标记柱。
图2
图2
E（z）-ESC复合物的常规纯化。(A类)用于分离PRC2和其他HMT的净化程序示意图。与DEAE纤维素柱结合的三种H3特异性HMT表示为I、II和III。棕色曲线显示了在不存在组蛋白H1的情况下DEAE纤维素组分在寡核小体上的HMT活性，橙色曲线显示了在存在H1的情况下的活性。使用和不使用组蛋白H1进行HMT分析，使我们能够清楚区分与色谱柱结合的三个不同的活性峰。如Nishioka等人（2002a，b）所述，在凝胶过滤柱上进一步分离每个峰。指出了不同H3-HMT的天然分子量。500-kD活性PRC2的纯化步骤如材料和方法一节所示。(B类)DEAE-5PW柱的HMT分析和Western blot分析。将凝胶过滤步骤产生的池分馏到DEAE-5PW柱上。使用组蛋白八聚体作为底物对柱的部分进行HMT活性分析。Western blot检测不同多肽的存在。HMT活性的两个峰值与E（z）和其他PRC2成分一致。这些峰被称为“络合物I”和“络合物II”。被鉴定为HDAC的蛋白质，与复合物I发生铜化反应，用圆点标记。(C类)在凝胶过滤Superose 12柱上分析PRC2纯化色谱的最后一步。这个顶部面板显示来自Superose 12色谱柱的馏分（10μL）的银染。与HMT活性相关的谱带用星号表示；分子尺寸标准的洗脱峰顶部SDS-PAGE分子量标记的位置显示在左边. The中间的面板显示了使用重组组蛋白八聚体作为底物的Superose 12组分（10μL）的HMT分析。显示组蛋白H3的位置。这个底部面板显示了使用所示抗体对Superose 12组分进行的Western blot分析。
图3
图3
PRC2 HMT活性的表征。(A类)用传统纯化的E（z）-ESC复合物进行底物特异性分析。所使用的不同底物包括重组八聚体（rOct）、天然HeLa八聚物（nAct）、使用重组组蛋白（rNuc）在体外组装的寡核小体以及使用天然组蛋白（nNuc）体外组装的少核小体。箭头表示添加了不同数量的PRC2。这个顶部面板显示自动射线照片和底部面板显示HMT分析膜的考马斯蓝染色。指出了不同组蛋白的位置。重组组蛋白的迁移显示在左边天然纯化的HeLa组蛋白的侧边和迁移在正确的侧面。(B类)使用天然核心组蛋白作为底物对分离的组蛋白H3进行Edman降解。HMT反应产物用SDS-PAGE分离，并切除标记的H3多肽并进行Edman降解。底部的数字代表降解循环，与H3尾部的氨基酸相对应。(C类)PRC2甲基化位点偏好性的测定。HMT测定是用重组组蛋白组装的八聚体进行的，使用野生型（Wt）组蛋白H3或含有以下氨基酸取代的组蛋白H3：K9到丙氨酸（K9A），K27到丙氨酸（K27A），以及K9和K27到丙氨酸的取代（K9/27A）。箭头表示添加不同数量的纯化PRC2。这个顶部面板是一张放射自显影中间的面板是HMT分析膜的考马斯蓝染色底部面板是自动射线照片的量化。(D类)使用GST融合蛋白测定组蛋白H3上的首选甲基化位点，其中候选甲基化位点被替换，如图所示。分析中使用了抗凝血亲和力纯化的E（z）-ESC复合物。GST-H3表示野生型H3尾巴；GST-H3-K4，一种H3尾部，其中K9和K27突变为精氨酸（K9R/K27R）；GST-H3-K9，K4R/K37R突变体；和GST-H3-K27，K4R/K9R突变体。顶部和底部面板与中的相同A类.
图4
图4
含有突变E（z）蛋白的PRC2的HMT活性。(A类)Ezh2【E（z）的小鼠同源物】、SUV39H1、G9A、Set9和PR-Set7的SET域的对齐。在欧洲生物信息学研究所服务器上使用CLUSTALW算法进行校准(http://www2.ebi.ac.uk/clustalw; 汤普森等人，1994年）。SET领域内的NHS共识用黄色表示。保守组氨酸689用红色表示，C588和R727残基用黄色表示。显示SET和Pre-SET域的边界。(B类)用从含有野生型E（z）蛋白或催化位点突变体的转染细胞纯化的PRC2进行HMT测定。通过反标记免疫亲和层析从293个细胞中纯化PRC2，这些细胞转染了空表达载体对照（Flag）或编码野生型E（z）[Flag-E（z）]或H689A突变[Flag_E（z，H689A]的表达载体。核提取物（～1 mg）用抗Flag M2琼脂糖免疫沉淀，肽洗脱液（20μL中的10μL）用于HMT分析。这个顶部面板显示了自动射线照片中间的面板显示HMT分析膜的考马斯蓝染色底部面板显示HMT分析反应的反Flag Western blot。(C类)HMT分析按照B类使用含野生型（Wt）E（z）蛋白或C588Y和R727K突变体的亲和纯化PRC2。这个顶部面板是反旗Western印迹底部该面板是HMT分析的放射自显影。(D类)含有C588Y或R727K E（z）突变体的亲和纯化PRC2复合物的甲基化位点偏好。GST-H3尾部融合蛋白野生型（wt）、双K9/K27突变体（K4）、双K4/K27突变体（K9）和双K4/K9突变体（K27）-使用越来越多的指示突变体PRC2复合物进行甲基化。这个顶部面板显示HMT化验的放射自显影中间的面板显示考马斯染色，显示分析中使用的GST底物数量相等底部该小组显示了抗FLAG蛋白印迹法，证明每组分析得到的复合物量大致相等。
图5
图5
PC1蛋白与H3尾部在K9和K27处甲基化的相互作用。(A类)面板中显示的下拉分析中使用的不同肽的示意图B类.体外翻译mPC1(35S-mPC1）或HP1(35S-HP1）蛋白与含有以下修饰物的固定化H3尾肽孵育：三甲基-K4（mK4）、三甲基-K9（mK9）、三甲基-K27（mK27）和三甲基-K9以及三甲基-K 27（mK 9/27）或未修饰的H3尾肽类（未修饰）。(B类)按照材料和方法中的描述清洗结合分析，并通过SDS-PAGE和放射自显影术分析与肽结合的蛋白质。这个顶部面板显示PC1与不含竞争对手BSA和中间的和底部面板显示HP1在缺失的情况下与指定肽结合(中间的)或存在(底部)肽序列和实验方案如面板顶部所示A类.
图6
图6
模型描述了组蛋白H3-尾上两个不同“标记”的建立。(中间)已知在体内乙酰化的H3-尾和赖氨酸（红色），以及在高等真核生物中甲基化但显然未乙酰化的K4和K27（蓝色）。(顶部)PRC2与组蛋白脱乙酰酶共同作用时建立的标记。在这种情况下，K9（以及可能的K14、Lys 18和Lys 23）被去乙酰化，从而创建一个可由PRC2访问的站点（K9）。以这种方式，PRC2使K9和K27甲基化。(底部)在没有组蛋白脱乙酰酶的情况下，PRC2只能甲基化K27，在组蛋白H3尾部形成一个“标记”，其功能与顶部面板。在这种情况下，K9保持乙酰化。
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