Identification and reconstitution of the yeast mitochondrial transporter for thiamine pyrophosphate

doi:10.1093/emboj/cdf583

。2002年11月1日；21(21):5653-61.

doi:10.1093/emboj/cdf583。

焦磷酸硫胺酵母线粒体转运体的鉴定和重组

C M T Marobbio公司¹, 一份Vozza, M哈丁, F Bisaccia公司, F帕尔米耶里, J E Walker公司

附属公司

PMID： 12411483
预防性维修识别码： PMC131080型
内政部： 10.1093/emboj/cdf583

焦磷酸硫胺酵母线粒体转运体的鉴定和重组

C M T Marobbio公司等。欧洲工商管理硕士J。 2002。

。2002年11月1日；21(21):5653-61.

doi:10.1093/emboj/cdf583。

作者

C M T Marobbio公司¹, 一份Vozza, M哈丁, F比萨西亚, F帕尔米耶里, J E Walker公司

附属

¹巴里大学药物生物学系，英国奥拉博纳4号。

PMID： 12411483
预防性维修识别码： PMC131080型
内政部： 10.1093/emboj/cdf583

摘要

酿酒酵母的基因组包含运输蛋白家族的35个成员，除一个例外外，在线粒体的内膜中发现。生化鉴定的15个线粒体载体的运输功能与穿梭底物有关，跨内膜的生物合成中间体和辅因子。本文描述了必需辅因子硫胺素焦磷酸（ThPP）的线粒体载体的鉴定。该蛋白在细菌中过度表达，重组成磷脂囊泡，并通过其转运特性进行鉴定。为了证实其身份，缺乏这种载体基因的细胞线粒体中的ThPP水平降低，乙酰乳酸合酶的活性降低，乙酰乳酸合酶是一种在器官基质中发现的需要ThPP的酶。它们还需要硫胺素才能在发酵碳源上生长。

PubMed免责声明

数字

**图1。**Tpc1p催化ThPP和ThMP的转运。(A类)酵母Tpc1p在*大肠杆菌。*蛋白质通过SDS-PAGE分离并用考马斯蓝染色。标记物（牛血清白蛋白、碳酸酐酶和细胞色素）的位置*c（c）*)如左图所示。1-4车道：*大肠杆菌*CO214（DE3）包含带有Tpc1p编码序列（通道2和4）和不带（通道1和3）的表达向量。在诱导时（泳道1和2）和5小时后（泳道3和4）采集样品。每个样品中分析的细菌数量相同。通道5：来自通道4中所示细菌的纯化Tpc1p（2µg）。(B类)Tpc1p的底物特异性。蛋白质脂质体内部预先装载有各种底物（浓度为10 mM）。通过外部添加0.2 mM[α-³⁵S] dATP，30分钟后停止。(C类)[α]流出-³⁵S] 用Tpc1p重组的蛋白质脂质体中的dATP。在pH6.0的条件下，在1 mM dATP、30 mM MES/30 mM HEPES（缓冲液A）的存在下重组蛋白脂质体。内部底物池通过载体介导的交换平衡进行标记。然后将蛋白质脂质体通过Sephadex G-75柱，用50 mM NaCl和0.1 mM MES/0.1 mM HEPES（pH 6.0）进行预平衡。[α]的流出-³⁵S] 通过在pH值为6时添加缓冲液A（填充正方形），在pH值8.0时添加缓冲剂A（填充圆形），在pH8.0时加入缓冲液A和20 mM的二氢萘酚和60µM的溶液，启动dATP第页-CMBS（开环）或缓冲液A，pH值8.0，含10 mM ThPP（填充三角形）。(D类和E类)Tpc1p对dATP单体跨膜pH梯度的依赖性。重组混合物包含10 mM dATP（dATP/dATP交换）或10 mM NaCl（dATP-uniport），以及pH值为8.0（D）或pH值为6.0至8.0（E）的缓冲液A。在将Tpc1p重组为脂质体后，使用50 mM NaCl和0.1 mM MES/0.1 mM HEPES的混合物在pH 8.0（D）或6.0至8.0（E）的不同pH值下进行平衡并洗脱Sephadex G-75柱。通过添加1 mM[α-³⁵S] dATP与缓冲液A在pH值6.0至8.0（D）或pH值6.0（E）时。反应在3分钟后终止：dATP单端口（填充正方形），dATP/dATP交换（填充圆形）。在三个独立的实验中也得到了类似的结果。(F类)外添加底物对[α]摄取的影响-³⁵S] dATP转化为用重组Tpc1p重组的蛋白脂质体。通过添加0.2 mM[α-³⁵S] dATP作用于不含底物的10mM NaCl蛋白质脂质体，3min后停止。将所有底物与[α-³⁵S] 最终浓度为0.8mM的dATP。报告了典型实验的抑制程度（%）。

**图2。** *tpc1Δ*该突变体对硫胺具有营养缺陷。(A类)的增长行为*tpc1Δ*在各种条件下。野生型和*tpc1Δ*将突变菌株接种在添加2%葡萄糖的固体SM上。如有指示，还存在0.4 mg/l硫胺、4 mg/ml HET、4 mg/ml噻唑、340µg/ml缬氨酸（VAL）或430µg/ml异亮氨酸（ILE）。(B类)Tpc1p的表达水平与SM培养基中硫胺的存在无关。用SDS-PAGE分离在添加或不添加硫胺（Th）的半乳糖补充SM上生长的野生型细胞的等量线粒体裂解物，转移到硝化纤维素中，并用针对Tpc1p的抗血清进行免疫修饰。

**图3。**ThPP进入线粒体需要Tpc1p。线粒体和线粒体后上清液（PMS）是从野生型和*tpc1Δ*细胞生长在补充半乳糖（A–D）或乙醇（E–H）的无硫胺SM上，或生长在补充半乳糖（Gal）、乙醇（Et）或乳酸（Lac）的YP（I和J）上。(A类和E类)线粒体来自*tpc1Δ*生长在半乳糖而非乙醇上的细胞在ALS活性方面存在缺陷。野生型和*tpc1Δ*细胞在含有0.05%Triton X-114和无丙酮酸盐ALS测定缓冲液的混合物中进行裂解，该缓冲液含有或不含有1mM ThPP。提取物在12000下离心克在4°C下保持10分钟。通过向提取物中添加50 mM丙酮酸，开始在30°C下进行ALS分析。(B类和F类) *tpc1Δ*PMS包含野生型PDC活动。来自野生型和*tpc1Δ*在30°C的含有75 mM MgCl的培养基中预先培养细胞，其中含有或不含有5 mM硫胺₂和20mM PIPES pH 7.0。3分钟后，将一等分预培养混合物添加到PDC的分析缓冲液中。(C类,D类和**G公司**–J型)线粒体，但非PMS，分离自*tpc1Δ*半乳糖培养的细胞（而不是乙醇或乳酸培养的细胞）ThPP水平降低。野生型和野生型的线粒体提取物（C、G和I）和PMS（D、H和J）*tpc1Δ*对细胞进行ThPP含量测定。

**图4。**Tpc1p在各种碳源上的表达比较。在补充有指定碳源的YP培养基上，从指数生长的细胞中获取细胞。葡萄糖*表示在二次移位后采集的细胞。用特异性抗血清对线粒体蛋白进行免疫修饰后，通过密度测定法估计Tpc1p蛋白的量。在四个独立的实验中也得到了类似的结果。半乳糖喂养细胞线粒体中Tpc1p的含量为100%。

**图5。**Tpc1p是线粒体内膜的一种完整蛋白质。(A类)酵母线粒体中Tpc1p的免疫印迹分析。来自野生型（1区）和*tpc1Δ*用SDS-PAGE分离突变体（第2道），转移到硝化纤维素中，并用针对Tpc1p和ADP/ATP载体（Aac2p）的抗体进行免疫修饰。(B类)Tpc1p不是通过碳酸盐处理从线粒体膜中提取的。通过SDS-PAGE和western blotting，使用针对Tpc1p、Aac2p（内膜成分）、Tom40p（外膜成分）和细胞色素的抗血清分析微丸的蛋白质b条₂（Cyt b₂; 膜间空间标记）和线粒体hsp70（mt-hsp70；基质蛋白）。将颗粒和上清液中的蛋白质总量设置为100%。(C类)用免疫印迹法测定线粒体的洋地黄素分级、Tpc1p、Aac2p和Tom40p。未萃取膜部分中的含量取100%。

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1. Barile M.、Passarella，S.和Quaglariello，E.（1990）分离的大鼠肝线粒体对硫胺素焦磷酸的摄取。生物化学。生物物理。，280, 352–357.-公共医学
1. Barile M.，Valenti，D.，Brizio，C.，Quaglariello，E.和Passarella，S.（1998年）大鼠肝线粒体可以将焦磷酸硫胺水解为磷酸硫胺，在载体介导的过程中可以穿过线粒体膜。FEBS信函。，435, 6–10.-公共医学
1. Cybulski R.L.和Fisher，R.R.（1981）《大鼠肝脏线粒体对氧化叶酸的摄取》，生物化学杂志。生物物理学。《学报》，646329–333。-公共医学
1. Daum G.、Bohni，P.C.和Schatz，G.（1982年）《蛋白质导入线粒体》。生物学报。化学。，257, 13028–13033.-公共医学

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[8] Cybulski R.L.和Fisher，R.R.（1981）《大鼠肝脏线粒体对氧化叶酸的摄取》，生物化学杂志。生物物理学。《学报》，646329–333。-公共医学

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