Agonist-induced PIP(2) hydrolysis inhibits cortical actin dynamics: regulation at a global but not at a micrometer scale

doi:10.1091/mbc.e02-04-0231

.2002年9月；13(9):3257-67.

doi:10.1091/mbc.e02-04-0231。

激动剂诱导的PIP（2）水解抑制皮层肌动蛋白动力学：在全球范围内而非微米范围内的调节

雅科·范·莱恩¹, 基斯·贾林

附属公司

PMID： 12221130
预防性维修识别码： PMC124157型
内政部： 10.1091/mbc.e02-04-0231

激动剂诱导的PIP（2）水解抑制皮层肌动蛋白动力学：在全球范围内而非微米范围内的调节

雅科·范·莱恩等。分子生物学细胞. 2002年9月.

.2002年9月；13(9):3257-67.

doi:10.1091/mbc.e02-04-0231。

作者

雅科·范·莱恩¹, 基斯·贾林

附属

¹荷兰癌症研究所细胞生物学部，荷兰阿姆斯特丹1066CX。

PMID： 12221130
预防性维修识别码： PMC124157型
内政部： 10.1091/mbc.e02-04-0231

摘要

质膜内叶的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP（2））被认为可以局部调节肌动蛋白细胞骨架。事实上，最近使用GFP-标记的pleckstrin同源结构域（GFP-PH）作为荧光PIP（2）传感器的研究表明，这种脂质在膜微结构域中富集。这里我们报告说，这个概念需要修改。使用三个不同的荧光GFP标记的pleckstrin同源结构域，我们表明高流动性GFP-PH贴片与各种亲脂膜染料完美共定位，因此，表示脂质含量增加，而不是富含PIP（2）的微结构域。我们表明，亮斑是由膜中的亚微观褶皱和皱褶引起的，可以用一种新的数值增强成像方法以大约15 nm的轴向分辨率直接显示。激动剂诱导的PIP（2）分解显著抑制了F-actin的运动，一旦PIP（1）水平恢复正常，F-actin运动就会恢复。因此，我们的数据支持PIP（2）在皮层肌动蛋白调节中的作用，但他们挑战了一个模型，即细胞骨架的PIP（1）调节存在微米尺度的空间差异。

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数字

图1
激动剂诱导的PLC激活对皮层肌动蛋白动力学的影响。（A）使用强度散点图检测肌动蛋白运动。收集表达GFP-actin的N1E-115细胞基底膜的时间序列共聚焦图像。对于每对后续图像*X（X）*和*Y（Y）*，每个像素的强度绘制为(*十、 Y（Y）*)散点图（详见材料和方法）。相同坐标的多次出现是彩色编码的。对于间隔2秒采集的一对图像，散射图显示沿对角线的分布（左侧散射图），由于固有的光子噪声，存在一些发散。对于以较长时间间隔拍摄的成对图像（顶部面板，t吨=0和2分钟），在图像集合之间移动的明亮肌动蛋白结构将明显显示为非对角的点簇（右散点图）。图中蓝灰色区域内的点表示2分钟内强度显著降低的像素；红灰区域包含2分钟后强度增加的所有像素。以固定的时间间隔（通常为30–120秒），通过计算延时序列中后续图像的非对角线像素分数，可以非常敏感地量化肌动蛋白运动随时间的变化。在合成（最右边）显微照片中，虚线区域的像素叠加在图像上。比例尺，0.5μm。（B–F）激动剂诱导的PIP的比较₂在单独的N1E-115细胞中水解（左侧面板）和肌动蛋白运动（右侧面板）。所示为表达内皮素B受体并用20 nM内皮素（ET）刺激的单个细胞（B）的反应；（C）用10μM组胺（HIS）刺激；（D）用1μM缓激肽（BK）刺激；和（E）表达脱敏缺陷型神经激肽a受体，并用1μM神经激肽（NKA）和（F）经1μM苯胂氧化物（PAO）预处理5分钟，用1μM缓激肽（BK）刺激。红色标记表示添加激动剂的时刻。

图2
GFP-PH和DiI的色谱化。用亲脂性膜染料DiI对表达GFP-PH的活N1E-115细胞进行染色。（A）使用共焦显微镜从内侧（顶部面板）和基底（底部面板）切片收集荧光蛋白和DiI图像。比例尺，5μm。（B） DiI的像素强度与GFP-PH强度在散点图中绘制。注意与图1中散点图的区别，其中一个荧光团在两个时间点成像。

图3
PIP期间GFP-PH和DiI的定位₂水解作用。表达GFP-PH的N1E-115细胞用DiI染色，并在共焦显微镜下的内侧（A）和基底（B）切片上成像。缓激肽（BK，1μM）诱导的PIP₂分解，导致GFP-PH移位。PIP再合成后₂（120秒时），GFP-PH返回膜。相反，DiI贴片（见箭头）在PIP期间仍留在膜上₂水解作用。比例尺：（A）5μm，（B）1μm。

图4
渗透性肿胀后GFP-PH斑块消失。（A）表达GFP-PH的NIH-3T3细胞在低张肿胀下的共焦图像。将培养基的渗透压从基础值350 mOsmol（1）调整为235（2）和120 mOsmole（3）。添加5μM的离子霉素（4），使荧光蛋白完全移位。（B）项目实施计划₂FRET在单细胞中按照相同的方案进行降解试验。注意，虽然肿胀消除了斑块，但总PIP₂细胞内几乎没有改变。比例尺，5μm。

图5
斑块处溶解膜下折叠的直接可视化。（A）共焦叠加*XY公司*-图像，间隔80 nm拍摄Z轴方向，显示GFP-CAAX表达N1E-115细胞的基底膜。（B）使用图像分析软件，在补丁内部（蓝色）和外部（红色）手动分配一个区域，并应用于整个图像堆栈。比例尺，2μm。（C）绘制蓝色和红色区域内测量的平均强度与堆栈中图像数的关系，可以重建物镜的轴向点扩散函数。使用过的徕卡63×油1.32 NA平面复消色差物镜的PSF（半宽最大值）为1.05μm，共焦针孔设置为0.58μm，发射λ=525nm。通过对归一化曲线偏移的分析Z轴-可以高精度地估计膜的位置。（D）通过逐点对图像堆栈应用此分析，以～15 nm的分辨率可视化贴片的三维表面轮廓。

图6
本地PIP₂梯度受到扩散的限制。（A）用DiI，bodipy-TR PtdIns（4,5）P标记细胞₂或双二氟C11-磷脂酰胆碱。用488或568 nm的0.2秒脉冲激光在神经突（红色痕迹）或躯体（黑色痕迹）的质膜上漂白斑点，并从共焦图像中量化恢复。注意，神经突（红线）光斑漂白后的恢复减少了几个数量级。（B）使用共焦显微镜在指定的时间点对表达GFP-PH和脱敏缺陷NK2受体的N1E-115细胞进行成像。通过应用（a）和吸液管（S）产生的神经激肽a（NKA）的精确限制流在正在发育的神经突中局部刺激PLC。产生的PIP₂降解被监测为GFP-PH易位（见箭头）。缓激肽也得到了类似的结果。图像的强度通过徕卡TCS软件的“辉光”颜色查找表进行彩色编码。比例尺，5μm。

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[2] Alblas J、van Etten I、Khanum A、Moolenaar WH。神经激肽-2受体的C末端截短导致激动剂诱导的信号增强和持续。受体磷酸化在信号衰减中的作用。生物化学杂志。1995;270:8944–8951.-公共医学

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[6] Botelho RJ、Teruel M、Dierckman R、Anderson R、Wells A、York JD、Meyer T、Grinstein S。吞噬部位磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的局部双相变化。细胞生物学杂志。2000;151:1353–1368.-项目管理咨询公司-公共医学

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