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.2002年9月；13(9):3235-45.
doi:10.1091/mbc.e02-02-0112。

中心体蛋白CG-NAP和kendrin通过锚定γ-管蛋白环复合物提供微管成核位点

高桥美智子 1, 山川昭子, Tamako Nishimura西村, Hideyuki Mukai先生, 小野吉隆
附属公司

中心体蛋白CG-NAP和kendrin通过锚定γ-管蛋白环复合物提供微管成核位点

高桥美智子等。 分子生物学细胞. 2002年9月.

摘要

微管组装由γ-管蛋白环复合物（γ-TuRC）启动。在酵母中，微管由固定在纺锤体极体组分Spc110p的氨基末端的γ-TuRC成核，后者在羧基末端与钙调蛋白（Cmd1p）相互作用。然而，固定gamma-TuRC的哺乳动物蛋白仍有待阐明。一种巨大的线圈蛋白CG-NAP（中心体和高尔基体定位PKN相关蛋白）通过羧基末端区域定位于中心体。通过酵母双杂交筛选发现该区域与钙调蛋白相互作用，并且与另一个中心体线圈蛋白kendrin的羧基末端区域具有高度同源性和/或GCP3。此外，内源性CG-NAP和kendrin相互免疫共沉淀，并与内源性GCP2和gamma-tubulin共沉淀，表明CG-NAP与kendin在体内形成复合物并与gamma-TuRC相互作用。这些蛋白定位于从分离的中心体成核的微管紫菀的中心。用CG-NAP或kendrin抗体预处理中心体适度抑制微管成核；此外，这些抗体的结合导致更强的抑制作用。这些结果表明CG-NAP和kendrin通过锚定gamma-TuRC在哺乳动物中心体中为微管成核提供了场所。

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数字

图1
图1
CG-NAP、kendrin及其缺失突变体的示意图。CG-NAP和kendrin的示意结构如阴影方框中预测的线圈区域所示。CG-NAP和kendrin缺失突变体的位置分别显示在上下两侧的氨基酸残基上。CG-NAP和kendrin之间的阴影区域表示通过BLAST搜索发现的具有同源性的区域。如材料和方法所述，本研究中使用的苦杏仁苷的总氨基酸残基为3246，短于存放于GenBank的（3321），登录号为U52962。
图2
图2
CG-NAP羧基末端区域的中心体定位。（A） CG-NAP缺失突变体的亚细胞定位。用HA标记的CG-NAP全长突变体和缺失突变体在COS7细胞中瞬时表达，然后直接用甲醇（a–d）或用洗涤剂短暂提取后固定细胞，以显示与细胞内结构（e，f）相关的蛋白质。然后，用抗HA和抗γ-微管蛋白（α-γTub）对细胞进行双重染色。棒材，10μm。（B） CG-NAP中心体定位区与kendrin的序列同源性。对齐序列是用CG-NAP进行BLAST搜索的结果3510–3828显示的剑麻素氨基酸残基为U52962，与我们的剑麻蛋白结构体的氨基酸残基不同。与酵母Spc110p（Flory）同源的kendrin可能的钙调素结合序列等。，2000）下划线。
图3
图3
中心体定位区CG-NAP的关联3510–3828含有钙调蛋白。（A） 酵母双杂交分析CG-NAP之间的相互作用3510–3828和钙调素2。融合到Gal4 DNA结合域（BD）和激活域（AD）的蛋白质之间的相互作用通过转染酵母蓝色的生长和发育进行评估。BD和AD构造的组合显示在右侧。以p53和SV40大T抗原为对照。（B） 直接和钙2+-CG-NAP的依赖性结合3510–3828含有钙调蛋白。细菌表达的His6-标记钙调素2和GST-标记CG-NAP3510–3828混合并在2 mM CaCl存在下培养2或EGTA。去除小份（输入）后，将谷胱甘肽-脑葡萄糖珠添加到混合物中并进一步孵育，然后收集与珠结合的蛋白质（输出）并用抗-His免疫印迹。黑色和白色箭头表示Ca的位置2+-钙调素的非结合形式和结合形式。（C） 钙2+-钙调素与CG-NAP的独立共免疫沉淀3510–3828.HA-标记的钙调蛋白2和FLAG-标记的CG-NAP3510–3828在COS7细胞中共表达，然后在2 mM CaCl存在下制备细胞提取物（Extr）2或EGTA。用抗FLAG（αFL）或对照（Ctr）小鼠IgG免疫沉淀提取物，然后用抗HA（顶部）或抗FLAG免疫印迹（底部）。黑色和白色箭头分别表示钙结合态和钙结合态钙调素的位置。
图4
图4
CG-NAP协会16–1229与γ-微管蛋白通过与GCP2/GCP3结合。（A） GCP2与CG-NAP缺失突变体的关联。CG-NAP的FLAG标记（FL）缺失突变体与HA标记的GCP2一起在COS7细胞中表达。然后用抗FLAG免疫沉淀（IP）细胞提取物，然后用抗HA免疫印迹（IB）。（B） γ-微管蛋白（γTub）与CG-NAP的间接关联16–1229通过与GCP2或GCP3结合。COS7细胞转染了各种表达质粒组合，如上图所示。然后用抗FLAG或对照小鼠IgG免疫沉淀细胞提取物，然后用抗Myc免疫印迹法检测γ-微管蛋白（顶部）、抗HA免疫印迹剂检测GCP2或GCP3（中部）或抗FLAG免疫印迹仪检测CG-NAP16–1229（底部）。
图5
图5
内源性和重组全长剑麻素的中心体定位。（A）剑麻素全长cDNA的制备。如材料和方法所述，剑麻素示意图显示了用于构建全长cDNA片段。位置用相应的氨基酸残基表示。KIAA0402来自Kazusa DNA研究所。产生特定抗体的片段位置显示为抗原。（B） 抗干扰素（αKen）抗体的特异性。用αKen免疫沉淀表达HA标记的kendrin、HeLa或CHO细胞的COS7细胞的细胞提取物，然后用抗HA（1–3道）或αKen（4–10道）免疫印迹。（C） 内源性kendrin的着丝粒定位。HeLa细胞用MeOH固定，然后用αKen和抗γ-微管蛋白（a，b）或抗CG-NAP（αEE）和抗γ-tubulin（C，d）双重染色。（D） 表达HA标记的肯德林的COS7细胞经甲醇固定，然后用抗HA和抗γ-微管蛋白双重染色。棒材，10μm。
图6
图6
通过与GCP2结合，肯德林与γ-微管蛋白（γTub）的结合。COS7细胞转染了各种表达质粒组合，如上图所示。然后用抗FLAG（αFL）或对照（Ctr）小鼠IgG免疫沉淀细胞提取物（Extr），然后用抗Myc抗体免疫印迹γ-微管蛋白（顶部），抗HA抗体免疫印记GCP2或GCP3（中部），或抗FLAG抗体免疫印痕kendrin1–1189（底部）。
图7
图7
内源性kendrin、CG-NAP、γ-微管蛋白和GCP2的相关性。（A） 内源性CG-NAP和肯德林的相关性。HeLa细胞提取物（Extr）用抗CG-NAP（αEE+αBH）或抗肯德林（αKen）或对照（Ctr）兔IgG免疫沉淀，然后用抗CG-NAP（αEE）（顶部）或αKen（底部）免疫印迹。（B） 重组kendrin与CG-NAP的关联。用FLAG-tagged（FL）CG-NAP和HA-taged kendrin共转染293T细胞。然后用抗FLAG或对照小鼠IgG免疫沉淀细胞提取物，然后用抗-FLAG（1-3道）或抗-HA（4-6道）免疫印迹。（C） 抗GCP2抗体的特异性。转染HA-标记GCP2或HeLa细胞的COS7细胞提取物用αGCP2免疫沉淀或对照兔IgG免疫沉淀，然后用αGCP1（1–3道）或抗HA（4–6道）免疫印迹。（D） GCP2与CG-NAP、kendrin以及γ-微管蛋白的关联。用αGCP2或对照兔IgG免疫沉淀HeLa细胞提取物，然后用抗CG-NAP（αEE）、αKen、αGCP2或抗γ-微管蛋白免疫印迹。
图8
图8
通过CG-NAP和kendrin抗体抑制分离中心体微管成核。CHO细胞裂解物按照材料和方法中描述的蔗糖密度梯度进行分级。然后通过免疫印迹法检测各组分中是否存在γ-微管蛋白（左）、CG-NAP和肯德林（右）。对应于40%至60%蔗糖之间的中间相的10–12组分富含中心体。（B） CG-NAP和kendrin在体外形成的微管紫菀中心的定位。如材料和方法所述，中心体部分在37°C下与牛微管蛋白在1 mM GTP存在下孵育8 min。将所得微管紫菀用戊二醛固定，并旋下在盖玻片上。然后对盖玻片进行处理，用抗CG-NAP（αEE）和抗α-微管蛋白（a–c），或αKen和抗α-tubulin（d–f）进行双重染色。棒材，10μm。（C） 通过用CG-NAP和kendrin抗体预处理中心体来抑制微管成核。中心体部分用1.2 mg/ml浓度的CG-NAP抗体（αrXN）或kendrin（αKen）抗体预处理，或用αrXN+αKen组合（各1.2 mg/ml）或对照兔IgG（2.4 mg/ml）预处理在冰上保持30分钟。然后用牛微管蛋白孵育4分钟，进行微管成核。用抗α-微管蛋白免疫染色，观察微管紫苑。棒材，10μm。所示结果代表了五个不同的实验。
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