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.2002年12月10日；99补充4（补充4）：16438-45。
doi:10.1073/pnas.182436399。 Epub 2002年8月22日。

组蛋白H3赖氨酸4甲基化由Set1介导并促进分裂酵母活性染色质状态的维持

野野贤一 1, Shiv I S Grewal先生
附属公司

组蛋白H3赖氨酸4甲基化由Set1介导并促进分裂酵母活性染色质状态的维持

野野贤一等。 美国国家科学院程序. .

摘要

已知组蛋白H3在赖氨酸4（H3 Lys-4）或赖氨酸9（H3 Lys-9）处的甲基化分别定义了从裂变酵母到人类的活性和沉默染色体域。然而，在芽殖酵母中，H3 Lys-4甲基化对于端粒和核糖体DNA的沉默染色质组装也是必要的。在这里，我们证明了set1的缺失消除了裂变酵母中H3 Lys-4的甲基化，set1编码的蛋白质在氨基末端含有RNA识别基序，在羧基末端含有SET结构域。与芽殖酵母不同，分裂酵母中静默交配型区域和着丝粒的异染色质组装不需要Set1介导的H3 Lys-4甲基化。我们的分析表明，H3 Lys-4甲基化是一种稳定的组蛋白修饰，存在于整个细胞周期，包括有丝分裂。set1Delta细胞中H3 Lys-4甲基化的缺失与组蛋白H3乙酰化水平的降低相关，表明H3 Lys-4甲基化与H3尾部乙酰化之间存在机械联系。我们认为，H3 Lys-4的甲基化主要作用于维持转录平衡的常染色质结构域，这种修饰对于裂变酵母中异染色质的形成是不必要的，而裂变酵母利用H3 Lys-9甲基化。

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数字

图1
图1
SET域蛋白附件。蓬贝基因组。(A类)SET结构域蛋白质的系统发育树。该树是基于SET结构域中的氨基酸序列通过邻接方法构建的。比例尺等于0.05 aa的距离。SpSet(附件。蓬贝SET）成员（GenBank登录号：SpSet1，AL049728；SpSet2，Z99164；SpSet3，Z70043；SpSet5，AL031540；SpSet6，AL032684；SpSet7，AL049609；SpSet8，Z99568；SpSet9，AL132870）由爆炸使用以前标识的SET域作为查询。缩写：Hs，智人; 米，小家鼠. (B类)的示意图附件。蓬贝SET结构域蛋白。每个蛋白质的长度（以aa为单位）标注在右侧。保守结构域如下：RRM，RNA识别基序；Chromo、Chromodomain；PHD、PHD手指；富半胱氨酸、富含半胱氨酸结构域；Ser-rich、Serine-rich域。
图2
图2
删除集合1消除H3 Lys-4甲基化。(A类)野生型细胞（SPG1236）用抗H3 Lys-4-甲基（H3K4Me）抗体（红色）、抗Nop1抗体（绿色）和DAPI（蓝色）染色。(B类)用H3K4Me抗体对野生型（SPG1236）制备的粗体组蛋白进行蛋白质印迹，以及集合1Δ（SPK10）应变。考马斯染色平行检查相同样品，以显示组蛋白负载。(C类)野生型和集合1Δ（SPK10）细胞用抗H3K4Me和DAPI染色。(D类)野生型（SPG1236）和集合1Δ（SPK10）应变。野生型和突变菌株在30°C的富含YEA的培养基中生长。固定时间点的单元格数绘制在半对数图上。(E类)的温度灵敏度集合1Δ应变。将之前在允许生长条件（30°C）下生长的菌株复制到YEA平板上，并在30°C或37°C下培养过夜。
图3
图3
SpSet1的RRM对于其在H3 Lys-4甲基化中的作用是必需的。(A）集合1和集合1的示意图ΔRRM. (B类)用野生型（SPG1236）制备的粗体组蛋白H3K4Me抗体进行Western blot，集合1Δ（SPK10），以及集合1Δ注册风险管理（SPK121）菌株。考马斯亮蓝（CBB）染色显示为负荷控制。
图4
图4
的影响集合1沉默和异染色质组装缺失。(A类)碘染色分析。野生型和集合1Δ菌落在PMA上产孢+介质温度为25°C，摄影前暴露于碘蒸汽中。(B类和C类)删除集合1不影响交配型区域和着丝粒的沉默。含有的菌株尿酸4+插入交配型基因座的基因(Kint2型∷尿酸4+)或染色体I的着丝粒区域(国际货币兑换率∷尿酸4+和otr1R∷尿酸4+)使用H3 Lys-4-甲基（K4）、H3 Lys-9-甲基（K9）或Swi6蛋白抗体进行ChIP分析。采用竞争PCR策略分析来自ChIP或WCE（全细胞粗提物）的DNA，通过一组引物扩增来自尿酸4+标记基因与控制乌拉4DS/E类小基因位于内源常染色位置。比率尿酸4+和控制乌拉4DS/E类ChIP和WCE中的信号用于计算各车道下方的相对富集度。NE表示未观察到富集。这个尿酸4+交配型和岑1通过稀释分析评估区域。细胞悬浮在水中，在非选择性（N/S）、反选择性FOA、AA-URA培养基上发现10倍系列稀释液，并在拍照前3天培养。
图5
图5
H3 Lys-4甲基化在整个细胞周期中都存在。(A类)野生型细胞用抗H3K4Me（红色）、抗管蛋白TAT-1抗体（绿色）和DAPI（蓝色）染色。对于每个单元，相应的面板都位于彼此下方。(B类)野生型和集合1用磷酸化H3 Ser-10（H3S10P）抗体对Δ细胞进行染色。
图6
图6
集合1Δ菌株在H3尾部赖氨酸残基处的乙酰化水平降低。(A类)大块组蛋白由野生型、，集合1Δ,clr3–735号机组、和第6类贷款-1菌株。用SDS/PAGE分离10微克粗组蛋白，并用H3K4me特异性抗体或在指示的赖氨酸残基处乙酰化的组蛋白H3或H4进行Western分析。考马斯染色（CBB）显示为负荷控制。在至少三个独立的实验中获得了类似的结果。(B类)中所示波段的强度A类，使用NIH量化形象软件，总结。
图7
图7
集合1Δ导致基因上H3 Lys-14乙酰化水平降低。(A类)用乙酰化H3 Lys-14（H3K14Ac）抗体进行ChIP分析。用多重PCR分析免疫沉淀组分（IP）和全细胞粗提物（W）的DNA片段。与基因编码区相对应的DNA片段的相对富集尿酸4,行为1，或ade6检查。来自沉默交配型区域的DNA片段(K（K）-已知缺乏H3 Lys-4-甲基和H3 Lys-14-乙酰基修饰的区域）被用作对照，以归一化和计算尿酸4，act1、和ade6IPed染色质部分的序列。(B类)分析ade6-216表型。野生型和集合1将Δ细胞划线到腺嘌呤类酵母提取物培养基上，并在30°C下培养2-3天。菌落的深红色或粉红色表明ade6-216表达式状态。的殖民地集合1Δ菌株的红色较野生型深，表明ade6在突变细胞中表达。
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