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.2002年8月1日；21(15):4183-95.
doi:10.1093/emboj/cdf401。

人类维持和从头DNA（胞嘧啶-5）甲基转移酶之间的合作和交流

金刚（Gun-Do Kim） 1, 倪景伟, 尼科尔·凯莱索格鲁, 理查德·罗伯茨, 斯里哈萨·普拉丹
附属公司

人类维持和新生DNA（胞嘧啶-5）甲基转移酶之间的协同作用和通讯

金刚（Gun-Do Kim）等。 浮雕J. .

摘要

三个不同的DNA（胞嘧啶-5）甲基转移酶家族，即DNMT1、DUMT2、DNMT3a和DNMT3b，参与了哺乳动物发育过程中基因组甲基化模式的建立和维持。这些酶有一个大的N末端结构域融合到催化结构域。催化结构域与原核（胞嘧啶-5）甲基转移酶同源，包含催化PC二肽，而N末端通过招募几个染色质重塑蛋白充当转录阻遏物。在这里，我们发现人类从头酶hDNMT3a和hDNMT3b与主要维持酶hDNMT1形成复合物。针对hDNMT1的抗体可降低这两种从头开始的酶。此外，酶的N末端参与蛋白质相互作用。免疫细胞化学染色显示，除hDNMT3a仅存在于细胞质中或同时存在于细胞核和细胞质中外，其余融合蛋白大多为核共定位。前甲基化底物DNA通过从头合成酶和维持酶表现出差异甲基化。体内hDNMT1和hDNMT3a或hDNMT4b的共同表达导致基因组中甲基化扩散，表明DNA甲基化期间新生酶和维持酶之间的合作。

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数字

无
图1。重组hDNMT的表达和结合分析体内。(A类)用于在Sf9细胞中表达DNMT的结构。hDNMT1的表达由杆状病毒p10启动子驱动。在同一结构中，多面体（pPH）启动子表达hDNMT3a或hDNMT4b，如箭头所示。(B类)hDNMT3抗体的特异性。蛋白质hDNMT3a或hDNMT4b显示在每个面板的顶部，抗体显示在底部。每条通道含有0.4µg纯化抗原。分子量标记如左图所示。(C类)昆虫细胞提取物中hDNMT表达的Western blot分析。每个面板的顶部显示了单独表达hDNMT3a、单独表达hDNA MT3b或DNMT1加上hDNA MT3或hDNMT3的Sf9细胞的提取物，底部显示了使用的抗体。Sf9车道是一个控制单元提取。(D类)在表达重组酶的Sf9细胞中与抗DNMT共免疫沉淀。用于免疫沉淀的抗体显示在顶部。以单克隆抗GFP作为对照。表达hDNMT1和hDNMT3a的昆虫细胞提取物用抗hDNMT3免疫沉淀，表达hDNMT 1和DNMT3b的昆虫细胞提取液用抗hDNA MT3b免疫沉淀。免疫前血清标记为PI。箭头显示hDNMT1的相对位置，以及作为阳性对照的纯化hDNMTl。(E类)维持免疫共沉淀的甲基转移酶活性从头开始酶。如图所示，表达hDNMT1和hDNMT3a的Sf9细胞提取物（左），或表达hDNMT 1和hDNA MT3b的细胞提取物（右），用抗DNMTs抗体进行免疫沉淀。使用poly（dI–dC）·poly（d I–dC）底物DNA和氚化AdoMet检测免疫沉淀产物的hDNMT1活性。
无
图2。DNMT在人类细胞中的表达谱和相互作用。(A类)显示了DNMT1（顶部）、DNMT3a（中部）和DNMT3b（底部）的蛋白质印迹分析。如顶部所示，使用了不同细胞系的核提取物以及阳性对照蛋白hDNMT1、hDNMT3a和hDNMT4b。分子量标记（kDa）位于最左边和最右边。箭头表示内源性DNMT的相对位置。请注意，用三种不同的抗体探测同一个western blot凝胶，以相对定量DNMT。(B类)HEK-293细胞核提取物中hDNMT的免疫沉淀。所使用的抗体显示在顶部。对照组hDNMT1、hDNMT3a和hDNMT4b蛋白用作参考。右边的箭头显示蛋白质的相对位置。使用抗-hDNMT1、-hDNMT3a和-hDNMT3 b抗体进行检测。hDNMT3b蛋白印迹上的另外两个箭头表示hDNMT2b的剪接变体。
无
图3。DNMT相互作用区域的详细映射。用于复合物形成的GST–DNMT融合肽显示在每个印迹的上方，氨基酸残基编号显示在括号中。阳性和阴性对照分别为纯化的hDNMT1、hDNMT3a、hDNMT 3b和GST蛋白。分子量标记以kDa为单位。用于斑点的抗体显示在每个面板下方。(A类)结合hDNMT1与hDNMT3a的各种GST融合片段的免疫印迹。(B类)与（A）相似的免疫印迹显示hDNMT3b的各种GST融合肽与hDNMT1结合。(C类)hDNMT1的hDNMT3a结合区的鉴定。(D类)hDNMT3a的hDNMT1结合区的精细映射。(E类)结合hDNMT3b与hDNMT1的各种GST融合片段的免疫印迹。(F类)hDNMT3b的hDNMT1结合区的精细映射。(G公司)hDNMT3a结合区域。(H（H）)hDNMT3a的hDNMT3结合区。(我)DNMT各功能区的汇总图。氨基酸残基用于各种DNMT。还指出了其他蛋白质结合域的相对位置，以供参考。增殖细胞核抗原（PCNA）、视网膜母细胞瘤基因产物（Rb1）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）、DNA甲基转移酶相关蛋白（DMAP）和甲基化DNA依赖变构激活域（MDDAAD）。最近在hDNMT1的N末端发现并定位了另一个Rb结合区（Rb2）。蛋白质-蛋白质相互作用的氨基酸残基适用于所有hDNMT。
无
图3。DNMT相互作用区域的详细绘图。用于形成复合物的GST–DNMT融合肽显示在每个印迹的上方，括号中显示氨基酸残基数。阳性和阴性对照分别为纯化的hDNMT1、hDNMT3a、hDNMT 3b和GST蛋白。分子量标记以kDa为单位。用于斑点的抗体显示在每个面板下方。(A类)结合hDNMT1与hDNMT3a的各种GST融合片段的免疫印迹。(B类)与（A）相似的免疫印迹显示hDNMT3b的各种GST融合肽与hDNMT1结合。(C类)hDNMT1的hDNMT3a结合区的鉴定。(D类)hDNMT3a的hDNMT1结合区的精细映射。(E类)结合hDNMT3b与hDNMT1的各种GST融合片段的免疫印迹。(F类)hDNMT3b的hDNMT1结合区的精细映射。(G公司)hDNMT3a结合区域。(H（H）)hDNMT3a的hDNMT3结合区。(我)DNMT各功能区的汇总图。氨基酸残基用于各种DNMT。还指出了其他蛋白质结合域的相对位置，以供参考。显示了增殖细胞核抗原（PCNA）、视网膜母细胞瘤基因产物（Rb1）、组蛋白脱乙酰酶（HDAC）、DNA甲基转移酶相关蛋白（DMAP）和甲基化DNA依赖性变构激活域（MDDAAD）。最近在hDNMT1的N末端发现并定位了另一个Rb结合区（Rb2）。蛋白质-蛋白质相互作用的氨基酸残基适用于所有hDNMT。
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图4。hDNMT的绑定顺序。用于酶复合物形成的hDNMT3a和hDNMT4b的GST–DNMT融合肽在每个印迹上方显示，氨基酸残基编号显示在括号中。阳性和阴性对照分别为纯化的hDNMT1、hDNMT3a、hDNMT 3b和GST蛋白。分子量标记以kDa为单位。用于斑点的抗体显示在每个面板下方。(A类)结合hDNMT1到GST珠上hDNMT3a的各种GST融合片段的免疫印迹。(B类)一个类似的免疫印迹显示hDNMT3b的各种GST融合肽在与hDNMT1结合的GST珠上。(C类)识别与hDNMT1–DNMT3a复合物结合的全长hDNMT3b。(D类)识别与hDNMT1–DNMT3b复合物结合的全长hDNMT3a。
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图5。转染pGFPDNMT446（hDNMT1）、pcDNAGST3A403（hDNMT3a）和pcDNAHis3b515（hDNMT 3b）或表达融合/标记hDNMT蛋白的这些克隆组合的COS-7细胞的典型共焦激光扫描显微镜图像。hDNMT1显示为绿色，hDNMT3a显示为红色，hDNMT3b显示为蓝色。hDNMT1和hDNMT3a的合并图像为绿色；hDNMT1和hDNMT3b为白蓝色。hDNMT1、hDNMT3a和hDNMT4b的合并图像为白色。hDNMT1和hDNMT3a的转染和定位。(A类)GFP–hDNMT1(B类)GST–hDNMT3a和(C类)hDNMT1和hDNMT3a的合并。请注意，hDNMT3a既是核又是细胞质。所有三种hDNMT的转染：(D类)GFP–hDNMT1(E类)GST–hDNMT3a(F类)他的–hDNMT3b和(G公司)合并所有hDNMT。请注意，hDNMT3a只是细胞质（E和G）。另一组转染显示所有三种hDNMT：(H（H）)GFP–hDNMT1(我)GST–hDNMT3a(J型)他的–hDNMT3b和(K（K）)合并所有hDNMT。注意，在这一组中，DNMT3a定位在细胞核和细胞质（I和K）中。所有三个hDNMT均显示核共定位。在另一组转染中，所有三个hDNMT均位于细胞核内：(L（左）)GFP–hDNMT1(M（M）)GST–hDNMT3a(N个)他的–hDNMT3b和(O（运行）)合并所有hDNMT1。(P（P）和问)hDNMT的核共定位。绿色表示GFP–hDNMT1，红色表示GST–hDNMT3a或His–hDNMT 3b。合并的表达式模式为黄色或绿色。
无
图6。预甲基化底物DNA的差异甲基化体外和甲基化扩散体内.体外使用预甲基化底物进行甲基化(A类)hDNMT1(B类)hDNMT3a或(C类)hDNMT3b。将等摩尔浓度的DNMT添加到反应混合物中。hDNMT1在30分钟后和hDNMT3a或hDNMT4b在1小时后测量掺入量。实验进行了两次，并报告了两次独立实验的平均值。(D类)DNA甲基化扩散的协同操作体外hDNMT1和hDNMT3b（实心菱形）、hDNMT1、hDNMT3a和hDNMT3b（空心正方形）、hDNMT1和hDNMT3a（实心正方形）、hDNMT1（实心圆）、hDNMT3a（空心圆）、hDNMT3a和hDNMT3b（实心三角形）以及hDNMT3b（空心菱形）的反应速度曲线。hDNMT3a、hDNMT4b、hDNMT3a和hDNMT2b的甲基化反应相似，数据点重叠。绘制了两个独立数据点的平均值。甲基化速率如表I所示。(E类)甲基化扩散体内.在有（+）或无（-）辅因子GTP的情况下，纯化并用McrBC消化来自表达不同hDNMT的昆虫细胞的基因组DNA（如顶部所示）。在1.2%琼脂糖凝胶上分析消化的DNA。使用10 kbp至100 bp的阶梯作为标记。嗯，未甲基化；hm，半叶化；我，甲基化了。
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图7。DNA甲基化模型。(A类)通过DNMT3a和DNMT3b进行的mCpN甲基化。DNMT3s可以催化mCG、mCA、mCT和mCC甲基化体内单独或一起。这种甲基化在哺乳动物发育的植入前阶段占主导地位。较短的DNMT1，缺乏118个氨基酸，停留在细胞质中，但胚胎的8细胞期除外（Mertineit等人，1998年）。缺少该N末端区域可能会导致从头开始和维持甲基转移酶。(B类)通过DNMT进行DNA甲基化。DNMT1和DNMT3b均位于细胞核内。DNMT3a可与DNMT3b或全长DNMT1相互作用。过量的DNMT3a被护送到细胞质，或者细胞质DNMT3a不允许进入细胞核。DNMT1确保细胞中CG甲基化。核膜显示为虚线圆圈。
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