A gamma-secretase inhibitor blocks Notch signaling in vivo and causes a severe neurogenic phenotype in zebrafish

doi:10.1093/embo-reports/kvf124

.2002年7月；3(7):688-94.

doi:10.1093/embo-reports/kvf124。

γ-分泌酶抑制剂阻断体内Notch信号传导并导致斑马鱼出现严重的神经原表型

安德烈亚·戈林¹, 哈拉尔德·斯坦纳, 迈克尔·威廉姆, 劳雷·巴利·库夫, 克里斯蒂安·哈斯

附属公司

PMID： 12101103
预防性维修识别码：项目编号：1084181
内政部： 10.1093/embo-reports/kvf124

γ-分泌酶抑制剂阻断体内Notch信号传导并导致斑马鱼出现严重的神经原表型

安德烈亚·戈林等。 EMBO代表. 2002年7月.

.2002年7月；3(7):688-94.

doi:10.1093/embo-reports/kvf124。

作者

安德烈亚·戈林¹, 哈拉尔德·斯坦纳, 迈克尔·威廉姆, 劳雷·巴利·库夫, 克里斯蒂安·哈斯

附属

¹斑马鱼神经遗传学初级研究小组，德国特罗格斯特拉斯慕尼黑工业大学病毒学研究所。

PMID： 12101103
预防性维修识别码：项目编号：1084181
内政部： 10.1093/embo-reports/kvf124

摘要

通过阻断γ-分泌酶活性抑制淀粉样β肽（Abeta）的产生是目前减缓阿尔茨海默病病理进展最有希望的治疗策略之一。γ-分泌酶抑制剂通过干扰早老素（PS）功能明显阻断阿贝塔生成。除了是γ分泌酶复合物的重要成分外，PS本身可能是一种具有γ分泌酶活性的天冬氨酸蛋白酶，这不仅是Abeta产生所必需的，也是参与Notch信号传导的类似蛋白水解过程所必需的。在这里，我们证明了用已知的γ分泌酶抑制剂治疗斑马鱼胚胎会影响胚胎发育，其影响方式在形态学、分子和生物化学水平上与Notch信号缺陷无法区分。这表明γ-分泌酶抑制剂在任何Notch依赖的细胞命运决定中都有严重的副作用，并证明斑马鱼是一种理想的脊椎动物系统，可以在体内条件下验证选择性影响Abeta生成而非Notch信号的化合物。

PubMed免责声明

数字

**图1。**DAPT阻断Notch内蛋白水解并抑制HEK293细胞中zfPS1依赖的γ-分泌酶和S3蛋白酶活性。(A类)NotchΔE cDNA稳定转染HEK293细胞（Schroeter等使用或不使用1µM DAPT处理细胞裂解液4 h。通过使用这些Notch变体C末端myc标签的抗体9E10进行免疫印迹，分析NotchΔE（NΔE；Notch的未分离形式）和NICD（Notch的裂解形式）。(B类)图1-3：用抗体zfPS1通过免疫印迹分析用所示zfPS1 cDNA稳定转染的HEK293/sw细胞的细胞裂解物_环3027至人类PS1或3711至人类PS2。请注意，内源性人类PS1和PS2被zfPS1变体取代。用过度表达的PS变体替换内源性PS是异位PS并入具有生物功能的PS复合体（Thinakaran等., 1997). 第四组：用抗体6687免疫印迹法分析细胞裂解液中的APP CTF。第5组：用抗体3926/6E10进行免疫沉淀/免疫印迹分析条件培养基中的总Aβ（Aβ40和Aβ42）物种。免疫沉淀物在Tris–bicine–尿素凝胶上分离，该凝胶允许识别aβ40和aβ42（Wiltfang等., 1997). 请注意，wt-zfPS1的表达不仅可以产生强大的Aβ（Aβ40和Aβ42），还可以增加Aβ42（Leimer等., 1999). (C)表达wt-zfPS1或突变zfPS1-D374N的HEK293/sw细胞被NotchΔE cDNA稳定转染（Schroeter等和细胞裂解物分析缺口ΔE（NΔE）和NICD，如（A）所示。(D类)稳定表达wt-zfPS1的HEK293/sw细胞经或不经1µM DAPT处理4 h，并用抗体3926直接免疫印迹分析APP CTF和Aβ。(E类)将稳定表达wt-zfPS1的HEK293/sw细胞用增加量的DAPT处理4 h，并对细胞裂解物进行NotchΔE（NΔE）和NICD分析，如（A）所示。

**图2。**DAPT影响体细胞生成(A类–**H（H）**)和神经发生(我–**L（左）**)体内与Notch信号缺陷无法区分。在24小时[（A）和（B），实时视图]或在15个体节（C–L）观察到的模拟处理（A，C，E，G，I，K）和DAPT处理（B，D，F，H，J，L）胚胎，在完整安装后进行平面安装就地与探针杂交显示，除（E）和（F）（背视图）外，左侧前方和背向上。（A–H）、（K）和（L）是躯干和尾部的特写视图；（一）和（J）是大脑的特写视图。DAPT治疗改变体液边界[箭头（A）和（B）]。它影响体节中胚层的AP极化，通常通过以下互补表达揭示*功能梯度8*和*肌营养不良*[（C）和（E）中的箭头]，并随机化周期依赖基因的表达，如*papc公司*在新生体节中[（G）和（H）中的箭头]。在胚胎神经系统中，DAPT触发了神经原表型*ngn1型*-每个神经前束簇中的阳性成神经细胞[比较（I）和（J）、（K）和（L）中箭头标识的簇]。D、假定间脑；ep，骺丛；i、中间神经元；m、运动神经元；s、感觉神经元；T、假定端脑；tel，端脑簇；vrc，口腹侧簇。

**图3。**Notch可溶性细胞质域的表达可阻止DAPT介导的Notch信号传导抑制。平板安装，模拟处理(A类和A类′）和DAPT-处理(B类和B类′）胚胎在10个体节出现就地杂交*ngn1型*表达（蓝色染色）（背视图，左前方）。将所有胚胎注射到4个细胞的一个卵裂球中，该卵裂球具有NICD-编码*网络接口卡*RNA和*nlslacZ公司*RNA作为谱系示踪剂（棕色细胞核识别注射卵裂球的后代）。（A′）和（B′）（相同放大倍数）分别是（A）和（B）中装箱区域的放大视图。注入(*+网络接口卡*)和非注射（未注射）区域显示在胚胎中线的两侧，并在（a′）和（B′）中用虚线框起来。DAPT显著增加了神经板内初级神经元的数量（图2L和图3B′中的非投射区与3A′相比），而*网络接口卡*具有相反的效果（比较A′中的注射区域和非注射区域）。请注意，NICD活动覆盖了DAPT的神经原效应，因为神经元数量也随之减少*网络接口卡*有无DAPT表达[比较注射侧（A′）和（B′）]。

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1. Berezovska O.，Xia，M.Q.和Hyman，B.T.（1998）Notch在成人大脑中表达，与早老素-1共存，在阿尔茨海默病中发生改变。神经病理学杂志。实验神经学。，57, 738–745.-公共医学
1. Berezovska O.等人（2000年），早老素和γ-分泌酶抑制剂中的天冬氨酸突变都会损害Notch1蛋白水解和核移位，并相对保留Notch1信号。神经化学杂志。，75, 583–593.-公共医学
1. Blader P.和Strahle，U.（2000）斑马鱼发育遗传学和中枢神经系统发育。嗯，分子遗传学。，9, 945–951.-公共医学
1. Blader P.、Fischer，N.、Gradwohl，G.、Guillemont，F.和Strahle，U.（1997）神经生长素1的活性受斑马鱼胚胎中的局部线索控制。发展，124，4557–4569。-公共医学
1. Capell A.等人（1998年）阿尔茨海默病相关早老素-1的蛋白水解片段形成异二聚体，并以100-150-kDa分子量复合物的形式出现。生物学杂志。化学。，273, 3205–3211.-公共医学

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[1] Berezovska O.，Xia，M.Q.和Hyman，B.T.（1998）Notch在成人大脑中表达，与早老素-1共存，在阿尔茨海默病中发生改变。神经病理学杂志。实验神经学。，57, 738–745.-公共医学

[2] Berezovska O.，Xia，M.Q.和Hyman，B.T.（1998）Notch在成人大脑中表达，与早老素-1共存，在阿尔茨海默病中发生改变。神经病理学杂志。实验神经学。，57, 738–745.-公共医学

[3] Berezovska O.等人（2000年），早老素和γ-分泌酶抑制剂中的天冬氨酸突变都会损害Notch1蛋白水解和核移位，并相对保留Notch1信号。神经化学杂志。，75, 583–593.-公共医学

[4] Berezovska O.等人（2000年），早老素和γ-分泌酶抑制剂中的天冬氨酸突变都会损害Notch1蛋白水解和核移位，并相对保留Notch1信号。神经化学杂志。，75, 583–593.-公共医学

[5] Blader P.和Strahle，U.（2000）斑马鱼发育遗传学和中枢神经系统发育。嗯，分子遗传学。，9, 945–951.-公共医学

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[7] Blader P.、Fischer，N.、Gradwohl，G.、Guillemont，F.和Strahle，U.（1997）神经生长素1的活性受斑马鱼胚胎中的局部线索控制。发展，124，4557–4569。-公共医学

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