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.2002年6月；13(6):2091-105.
doi:10.1091/mbc.01-10-0500。

Gin4-septin复合物的细胞周期依赖性组装

埃里克·莫滕森 1, 海斯·麦克唐纳, 约翰·耶茨第三, 道格拉斯·R·凯洛格
附属公司

Gin4-septin复合物的细胞周期依赖性组装

埃里克·莫滕森等。 分子生物学细胞. 2002年6月.

摘要

Gin4是一种与Nim1相关的激酶，在出芽酵母中需要它来定位间隔蛋白并在G2/M期间适当控制子细胞的生长。当细胞进入有丝分裂时，Gin4变得过度磷酸化，导致Gin4激酶活性的激活。在本研究中，我们使用免疫亲和色谱法来鉴定有丝分裂期间与Gin4相关的蛋白质，目的是寻找Gin4激酶活性的靶点和在Gin4激活中起作用的蛋白质。我们发现，在有丝分裂期间，Gin4被组装成一个多蛋白复合物，其中包括Nap1、Bni5、septins和至少两个Gin4分子。此复合物中相关的Gin4分子相互磷酸化，导致Gin4过度磷酸化。此外，复合物中的Shs1 septin在有丝分裂期间经历了Gin4依赖性磷酸化，并且在体外似乎是Gin4的底物，这表明它是体内Gin4激酶活性的靶点。遗传数据支持Shs1是Gin4激酶活性的重要靶点的观点。在有丝分裂期间，Gin4与隔膜蛋白的结合需要Shs1、Nap1、Cla4、Elm1以及Gin4和Cdc28的激酶活性。Gin4分子的自结合需要Shs1而不是Cla4或Nap1。先前的工作表明，这些七肽作为一种紧密复合物一起发挥作用，我们发现细胞中的大多数Shs1与其他七肽Cdc3、Cdc10、Cdc11和Cdc12紧密结合。然而，有趣的是，在Cdc11 septin不与Gin4结合的条件下，Shs1可以结合到Gin4并诱导Gin4齐聚，这表明Shs1能够独立于其他septin发挥作用。综上所述，这些发现表明，高度调控的蛋白结合事件确保了Gin4激酶仅在有丝分裂期间被激活，并且仅与Shs1（一种可能的Gin4体内底物）相关。此外，这些结果为Gin4如何调节七肽的定位或功能提供了线索。

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数字

图1
图1
Gin4自动磷酸化是由于分子间事件。表达3×HA标记的单倍体或二倍体细胞野生型的版本GIN4公司和/或催化非活动的GIN4公司(轧棉机4K48A型)在有丝分裂中被捕使用微管解聚药物苯诺明电泳迁移率3×HA-GIN4由监控用抗HA抗体进行免疫印迹。携带野生型的菌株3×HA-GIN4G1中包含α因子用于比较。每个菌株的基因型显示在图中，细胞周期停止点如下所示（I，界面；M、 有丝分裂）。
图2
图2
Gin4寡聚化是有丝分裂特异性的。A菌株携带3×HA-GIN4和GST-GIN4（EM9菌株）的人在间期或有丝分裂，GST-GIN4免疫沉淀抗GST抗体。通过以下方法检测3×HA-Gin4的共沉淀沉淀与抗HA抗体的免疫印迹。A控件免疫沉淀（IP）使用等量的非特异性抗体。粗提取物的蛋白质印迹显示3×HA-Gin4在间期和有丝分裂期的水平相等细胞和用于免疫沉淀表明，等量的GST-Gin4由间期细胞和有丝分裂细胞沉淀。细胞周期阻滞点显示在每个面板上方（I，间期；M，有丝分裂）。注释用于这些蛋白印迹的凝胶运行时间不够长使Gin4亚型完全分离，因此看起来有点像与图1所示的Western blots不同。
图3
图3
从中纯化Gin4多蛋白复合物细胞在有丝分裂中停滞。（A） 携带HA标签的酵母细胞GIN4公司在有丝分裂过程中被捕用抗HA珠或抗GST对照珠培养细胞。洗涤后，用过量的HA二肽洗脱两个色谱柱。纯化程序每个步骤的样品都被装载到10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，考马斯蓝染色。这个标有“LSS”和“HSS”的车道为低速和高速分别是上清液和标有“flowthrough”的车道代表来自抗HA免疫亲和柱的未结合的蛋白质。星号表示抗体重链。箭头表示两个我们在纯化过程中一直看到的背景蛋白。质量光谱分析将其确定为Ssa1和Ssa2。（B） 相同的将A中显示的组分装入10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中转移到硝化纤维。用抗Gin4-HA、，抗Shs1、抗Cdc11和抗Nap1抗体。
图4
图4
Gin4与Cdc11在有丝分裂特异性方式。（A） 对数期细胞在G1中同步用α因子处理，每15min取样一次从逮捕中释放。每个人的Gin4都被免疫沉淀（IP）样品，Cdc11和Nap1的共沉淀通过蛋白质印迹。此外，Nap1、Cdc11和Clb2的水平通过Western blotting分析粗提取物中的含量。以前的研究表明，在细胞周期（Altman和Kellogg，1997）。（B） 野生型和cdc28-4号细胞在室温下生长到对数期然后转移到37°C。Gin4与共沉淀法检测Cdc11。（C） 对数相细胞包含在Gal启动子的控制下，Cln3在G1中通过添加含葡萄糖的培养基，然后从逮捕。每30分钟取样一次，共沉淀与之前一样对Cdc11和Nap1进行分析。
图5
图5
有丝分裂Cdc28激酶活性是必需的用于Gin4过度磷酸化和复合物组装。（A） 单元格包含cdc28-as1等位基因在有丝分裂中被抑制然后用1NM-PP1处理或用DMSO模拟处理15分钟通过Western blotting检测Gin4蛋白的行为。（B） 杜松子酒4从指示样品中进行免疫沉淀（IP）Western监测了Nap1、Cdc11和Shs1的共沉淀吸墨纸。（C） A中显示的相同样本的蛋白质印迹显示用1NM-PP1处理的细胞中Clb2水平仍然很高。
图6
图6
复合物的体内要求组件。（A） Gin4是从指示的Western分析了Cdc11和Nap1的共沉淀吸墨纸。对粗提取物进行蛋白质印迹验证粗提取物中的蛋白质水平是否相等。（B） 杜松子酒4-Gin4通过以下方法监测指示菌株中的相互作用GST-Gin4的免疫沉淀和共沉淀测定3×HA-Gin4。注意，用于这些蛋白质印迹的凝胶不是运行足够长的时间以获得Gin4异构体的完全分辨率，因此与图1所示的Western blots略有不同。（C）Gin4是从年捕获的指示菌株中免疫沉淀的间期（I）或有丝分裂（M），Shs1的共沉淀是由Western blotting监测。
图7
图7
Shs1是一种磷酸蛋白有丝分裂期间的Gin4依赖性磷酸化。（A） 指示的菌株在间期被α因子阻滞，或在有丝分裂中被α因子阻滞诺卡唑，通过Western blotting监测Shs1的行为带有抗Shs1抗体。Shs1在快速生长中的行为同时对细胞进行了分析。星号表示可变背景我们在Shs1缺失中观察到的条带。（B） Shs1是抗Shs1有丝分裂阻滞细胞的免疫沉淀抗体，沉淀的Shs1在（+）存在下孵育或λ-磷酸酶缺失（−）。用磷酸酶治疗后，Western检测到不同磷酸化形式的Shs1吸墨纸。
图8
图8
Shs1是堆芯隔板的一个成员复合物，是Gin4激酶的体外底物。（A）3×HA-Shs1、3×HA-Gin4和3×HA-Gin4K48A型通过纯化在1 M KCl存在下的免疫亲和层析，以及纯化的蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。凝胶考马斯蓝染色。从细胞中纯化出3×HA-Gin4在有丝分裂中被阻止以获得活性的高磷酸化形式Gin4.星号表示抗体重链。箭头表示与伴侣蛋白相对应的两个背景带不断地在我们的净化中看到。（B） 提纯的杜松子酒4和提纯的七肽复合物在有[γ32P] ATP，反应加载到10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶。（C） 培养Gin4和septin复合物后带有[γ32P] ATP，蛋白质复合物被添加1%十二烷基硫酸钠并在100°C下培养。当时的样品用抗Shs1或抗GST对照珠培养。之后孵育后，将样品加载到10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。
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参考文献

    1. Adam JC、Pringle JR、Peifer M.果蝇败血症在胞质分裂和细胞化中功能分化的证据。分子生物学细胞。2000;11:3123–3135.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Altman R，Kellogg DR。通过Nap1和Gin4激酶控制有丝分裂事件。细胞生物学杂志。1997;138:119–130.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Anderson CW、Baum PR、Gesteland RF。腺病毒2诱导蛋白的处理。《维罗尔杂志》。1973;12:241–252.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Barral Y、Parra M、Bidlingmaier S、Snyder M.Nim1相关激酶与酵母外周细胞骨架的组织协调细胞周期进展。基因开发1999；13:176–187.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Beites CL，Xie H，Bowser R，Trimble W。七肽CDC-re1–1结合结合蛋白并抑制胞吐。自然神经科学。1999;2:434–439.-公共医学

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