Pleiotrophin/heparin-binding growth-associated molecule as a mitogen of rat hepatocytes and its role in regeneration and development of liver

doi:10.1016/S0002-9440(10)61167-4

.2002年6月；160(6):2191-205.

doi:10.1016/S0002-9440（10）61167-4。

多肽/肝素结合生长相关分子作为大鼠肝细胞有丝分裂原及其在肝脏再生和发育中的作用

金鸡细辛¹, 佐藤Hajime, 山崎千弘, 加藤美穗, 小川美穗, 片山茂, Chise Tateno公司, 吉崎Katsutoshi Yoshizato

附属公司

PMID： 12057922
预防性维修识别码：项目经理1850835
内政部： 10.1016/S0002-9440（10）61167-4

多肽/肝素结合生长相关分子作为大鼠肝细胞有丝分裂原及其在肝脏再生和发育中的作用

金鸡细辛等。美国病理学杂志. 2002年6月.

.2002年6月；160(6):2191-205.

doi:10.1016/S0002-9440（10）61167-4。

作者

金鸡细辛¹, 佐藤Hajime, 山崎千寻, 加藤美穗, 小川美穗, 片山茂, Chise Tateno公司, 吉崎Katsutoshi Yoshizato

附属

¹广岛组织再生项目、广岛县促进卓越技术区域实体合作、日本科学技术公司、广岛市工业科学技术研究所。

PMID： 12057922
预防性维修识别码：项目经理1850835
内政部： 10.1016/S0002-9440（10）61167-4

摘要

此前，在瑞士3T3细胞分泌的蛋白质中，发现了多肽（PTN）作为培养的成年大鼠肝细胞的有丝分裂原。本研究表明，与大鼠肝星状细胞（HSC）共同培养可促进大鼠肝细胞的生长。HSC在共培养中表达PTN mRNA并分泌其蛋白。重组PTN促进培养肝细胞的生长，表明HSC通过PTN的作用刺激肝细胞的增长。为了了解PTN在体内肝细胞生长中的生物学作用，我们检测了PTN在四种大鼠成年肝和胚胎肝再生模型中的表达。用D-氨基半乳糖（GalN）或乙酰氨基芴治疗后再行部分肝切除，可显著上调肝脏PTN mRNA的表达。HSC表达PTN mRNA以响应GalN处理，并在肝细胞上发现其蛋白。GalN处理的肝细胞中PTN受体N-syndecan的mRNA表达上调。包围胚胎肝的横隔间充质细胞（而非胚胎肝干细胞）表达PTN mRNA。我们认为PTN是由激活的成人肝干细胞和胚胎间充质干细胞分泌的，分别作为成人和胚胎肝实质细胞的有丝分裂原。

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数字

**图1。**
肝细胞在RSF、HSC或3T3细胞存在下的生长。肝细胞接种于4×10^三细胞/厘米²与丝裂霉素C处理的RSF、HSC或3T3细胞一起接种或不接种。让肝细胞生长10天，并测定第10天与第1天肝细胞数量的比率，作为生长速度的测量。每个值代表三次试验的平均值±SD。表示的值之间的差异括号对于*P（P）*< 0.01.

**图2。**
HSC、3T3细胞和RSF表达PTN和HGF的mRNA和蛋白。答：从HSC（HSC）、3T3细胞（3T3）和RSF（RSF）纯化的RNA的电泳。**B类：**HSC表达PTN mRNA的定量。用一系列含有PTN cDNA的稀释质粒绘制标准曲线(**开放的圆圈**)与阈值周期（Ct）。PTN mRNA的拷贝数(**闭合的圆**)用标准曲线计算HSC的RNA。**抄送：**RSF、HSC和3T3细胞培养4天，用于测定PTN、HGF、，*N个-*syndecan和GAPDH通过实时RT-PCR。HSC和3T3细胞，但RSF不表达PTN和HGF的mRNA。表示RSF，但不表示HSCN个-syndecan mRNA。**医生：**PTN蛋白印迹。培养3T3细胞、HSC或RSF的培养基C类收集并用hrPTN蛋白作为标准物，通过Western blot测定PTN的浓度(**正确的**，hrPTN）。PTN抗体与大小（18K）与hrPTN蛋白大小匹配的蛋白反应。培养基中PTN的浓度对于3T3细胞为18 ng/ml，对于HSC为12 ng/ml。而RSF没有分泌可测量数量的PTN。MW表示由标记蛋白迁移决定的分子量。**电子邮箱：**HGF在培养基中分泌。在中收集的媒体C类用于通过EIA测定HGF。HSC和3T3细胞（而非RSF）分别以8 ng/ml和12 ng/ml的浓度分泌HGF。每个值代表平均值±SD括号对于*P（P）*<0.05和***P（P）*< 0.01(n个=4，用于C类和n个=3用于E类).

**图3。**
PTN和HGF对肝细胞生长的影响。肝细胞以4×10培养^三细胞/厘米²在含有hrHGF（5ng/ml）和hrPTN（100ng/ml）或两者的培养基中。细胞也在3T3-CMs中培养。肝细胞的生长表现为第10天的肝细胞数与第1天肝细胞数的比值。每个值代表三次测量的平均值±SD。表示的值之间的差异括号在*级对*P（P）*<0.05和***P（P）*< 0.01 (n个= 4).

**图4。**
再生过程中PTN及其受体的基因表达。用GalN治疗大鼠(A类)，AAF/PHx(B类)、CCl₄(C类)和PHx(D类)或进行假手术(E类). 在治疗的指定日期或手术后获取肝脏样本，并通过实时RT-PCR mRNA检测PTN(**开放的圆圈**),*N个-*合成癸烷(**闭合的圆**)、HGF(**开放式广场**)、GAPDH(**闭合正方形**)，MK公司(**开放三角形**)和PTPζ(**闭合三角形**). 正常大鼠被用作对照，在每个图形的水平轴上显示为N。每个图中的纵轴显示PTN和HGF每pg总RNA的mRNA拷贝数(左边，左垂直轴），*N个-*合成癸烷(左边，右垂直轴），GAPDH(**正确的**，左垂直轴），以及MK和PTPζ(**正确的**，右垂直轴）。每个值代表三次测量的平均值±SD。测试正常组和治疗组之间的统计差异。统计显著性水平用*表示*P（P）*<0.05和***P（P）*< 0.01.

**图5。**
用GalN和AAF/PHx处理的肝脏中PTN mRNA及其蛋白表达细胞的鉴定。用GalN治疗大鼠2天(**A–D**,**F–H（飞行高度）**)或AAF/PHx 13天(我,J型).现场在GalN处理的小鼠中进行PTN mRNA杂交(A类,C类)和正常(E类)肝脏。用抗结蛋白抗体进行免疫组织化学(B类,D类)、PTN(F类,**H（H）**,我)，正常山羊IgG(克)、和AFP(J型).A类和**抄送：**PTN mRNA就地杂交。入口周围的截面(A类)和中央静脉(C类)显示了。PTN mRNA（蓝色）见于非实质组织(箭头).B类和**医生：**第节，共节A类和C类用于结蛋白免疫染色，产生B类和D类分别是。PTN mRNA-表达细胞箭头在里面A类和C类结蛋白染色同时阳性（绿色荧光细胞箭头在里面B类和D类). 由于这些细胞的自身荧光，实质细胞和血细胞分别被染成黄色和黄色。**电子邮箱：** 现场正常肝脏PTN mRNA杂交。显示了门静脉周围的截面。未发现阳性细胞。**传真：**肝细胞PTN染色阳性（棕色，箭头).德国：正常山羊IgG被用作第一个免疫染色抗体，作为阴性对照。肝脏没有信号。高：高倍放大F类.肝细胞(箭头)，但不是NPC(箭头)染色呈阳性。我：肝细胞(箭头)，但不是椭圆形细胞(箭头)，对PTN为阳性。**记者：**椭圆形单元格(箭头)但不是肝细胞(箭头)AFP阳性。bd，胆管；cv，中央静脉；ha，肝动脉；pv，门静脉。比例尺，50μm。

**图6。**
肝细胞PTN受体基因的表达谱。答：mRNA的表达水平*N个-*通过实时RT-PCR测定syndecan、PTPζ、ALK和GAPDH。从正常肝脏中分离PHs和SHs，并在HCGM中培养指定的天数。的mRNAN个-syndecan和PTPζ在培养过程中表达上调。ALK mRNA在这些细胞中无法测量。**B类：**mRNA的表达*N个-*GalN模型肝细胞中的syndecan和PTN。从正常大鼠的肝脏中分离出PHs、SHs和NPC(**开放式酒吧**)和那些接受GalN治疗2天的患者(**闭合钢筋**). 从这些细胞中分离出RNA，以测量*N个-*syndecan、PTN、PTPζ、ALK和GAPDH。的表达式*N个-*GalN处理的肝细胞中syndecan和PTN mRNAs比正常肝细胞中高很多。GalN处理诱导NPC上调PTN mRNA，但没有*N个-*辛迪坎。GalN处理诱导PHs和SHs上调*N个-*syndecan mRNA。PHs和SHs弱表达PTN mRNA。PTPζ和ALK的mRNA在这些细胞中无法测量。每个值代表平均值±SD。统计显著性水平用*表示*P（P）*<0.05和***P（P）*< 0.01 (n个=3用于A类,n个=4，用于B类).

**图7。**
发育中胎儿PTN mRNA及其蛋白的表达谱。11岁时从大鼠胎儿中制备矢状截面(A类,B类), 12 (C类,D类), 13 (E类,F类)和14 dpc(**G–J型**). 截面受就地使用PTN反义杂交(A类,C类,F类,克)和传感探头(B类)或使用PTN抗体进行免疫组织化学(D类,**H（H）**,我)和结蛋白(E类).答：PTN mRNA见于横隔（st；箭头，蓝色），但不在肝憩室（hd）；h；心脏。**B类：**PTN传感探头无信号。**抄送：**横隔可见PTN mRNA的强信号(箭头)而在发育中的肝脏中没有信号（l）。克；内脏。**医生：**成肝细胞和横隔抗PTN抗体阳性（棕色、，箭头).电子邮箱：hsc（hsc，绿色荧光，**小箭头**)结蛋白免疫染色阳性，横隔和心脏的间充质细胞阳性(**粗箭头**). 成肝细胞(箭头)和血细胞(星号)由于这些细胞的自身荧光，它们分别呈黄色和橙色。**传真：**PTN mRNA就地杂交。中所示的部分E类用于此实验。横隔中PTN mRNA的特异性高表达(**粗箭头**)，而HSC中未见表达(**小箭头**)和成肝细胞(箭头).德国：PTN mRNA在神经组织和间充质组织中表达。横隔强烈表达PTN mRNA(箭头). i；肠道，k；肾，鲁；肺，m；后脑，ma；下颌弓；神经管，t；端脑。高：在神经组织和上皮组织中可以看到对抗PTN抗体的免疫反应性。肝脏呈弱阳性(箭头).我：由**小正方形**在里面**H（H）**放大了。成肝细胞PTN免疫染色阳性(箭头).记者：进行的免疫染色与**H（H）**使用被hrPTN蛋白吸收的抗PTN抗体。未见免疫反应。标尺，50μm(**A–F**和我); 1毫米(克,**H（H）**、和J型).

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[1] Michalopoulos GK，DeFrances MC：肝再生。《科学》1997，276:60-66-公共医学

[2] Michalopoulos GK，DeFrances MC：肝再生。《科学》1997，276:60-66-公共医学

[3] McGowan JA：培养中的肝细胞增殖。Guillouzo A Guguen Guillouzo C编辑。分离和培养肝细胞的研究。1986年，第13-38页，巴黎，约翰·利比

[4] McGowan JA：培养中的肝细胞增殖。Guillouzo A Guguen Guillouzo C编辑。分离和培养肝细胞的研究。1986年，第13-38页，巴黎，约翰·利比

[5] Block GD、Locker J、Bowen WC、Petersen BE、Katyal S、Strom SC、Riley T、Howard TA、Michalopoulos GK：HGF/SF、EGF和TGFα在化学定义（HGM）培养基中诱导的肝细胞原代培养中的种群扩张、克隆生长和特异分化模式。细胞生物学杂志1996132:1133-1149-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Block GD、Locker J、Bowen WC、Petersen BE、Katyal S、Strom SC、Riley T、Howard TA、Michalopoulos GK：HGF/SF、EGF和TGFα在化学定义（HGM）培养基中诱导的肝细胞原代培养中的种群扩张、克隆生长和特异分化模式。细胞生物学杂志1996132:1133-1149-项目管理咨询公司-公共医学

[7] 菌株AJ、Ismail T、Tsubouchi H、Arakaki N、Nishida T、Kitamura N、Daikuhara Y、McMaster P：天然和重组人肝细胞生长因子是人类和大鼠肝细胞DNA合成的高效促进剂。临床研究杂志1991，87:1853-1857-项目管理咨询公司-公共医学

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[9] Tateno C，Yoshizato K：成年大鼠肝细胞的长期培养，这些肝细胞经历多个细胞分裂并表现出正常的实质表型。《美国病理杂志》1996，148:383-392-项目管理咨询公司-公共医学

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