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.2002年5月1日；21(9):2180-8.
doi:10.1093/emboj/219.2180。

抑制p21介导的活性氧积累可挽救p21诱导的衰老

萨尔瓦多·马基普 1, Makoto Igarashi先生, 李芳, 安格斯·陈, 潘振强, 山姆·W·李, 斯图亚特·阿伦森
附属公司

抑制p21介导的活性氧积累可挽救p21诱导的衰老

萨尔瓦多·马基普等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

细胞周期素依赖性激酶（CDK）抑制剂p21（Waf1/Cip1/Sdi1）最初被鉴定为在衰老细胞中诱导的基因，其本身已被证明会导致永久性生长停滞/衰老。活性氧（ROS）是氧化过程的副产物，也可以诱导类似衰老的不可逆生长停滞。在这里，我们发现p21增加了正常成纤维细胞和p53阴性癌细胞中ROS的细胞内水平。活性氧抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸挽救了p21诱导的衰老，表明活性氧升高是诱导永久生长停滞表型的必要条件。p16（Ink4a）是一种CDK4和CDK6特异性抑制剂，未能增加ROS水平，p16诱导的细胞周期阻滞在其下调后是可逆的，证明了p21效应的特异性。缺乏结合增殖细胞核抗原（PCNA）能力的p21突变体保留了诱导ROS和永久生长停滞的能力。所有这些发现都表明，p21通过一种涉及ROS积累的机制介导衰老，这种机制不需要其PCNA结合或与p16共享的CDK抑制功能。

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数字

无
图1。p21表达诱导EJp21细胞ROS水平的变化。(A类)荧光探针DCF染色后，通过FACS分析测量ROS水平。曲线对应于在tet（对照）存在下培养的（I）细胞和tet去除后2（II）或5（III）天。由于荧光增加而向曲线右侧移动表明细胞内ROS水平增加。(B类)与对照细胞相比，在p21诱导2或5天时，按照材料和方法中的描述测量细胞内谷胱甘肽水平。结果表示两个实验的平均值，误差条显示标准偏差*P（P）<0.007. (C类)暴露于不同tet浓度3天的EJp21细胞裂解物中p21表达水平的免疫印迹分析。对于相同的tet浓度，在第3天测量培养物中的ROS水平。相对ROS水平标准化为2.5×10–3µg/ml。结果代表每种浓度三次实验的平均值，误差条显示标准偏差*P（P）<0.007; **P（P）<0.05.
无
图2。501T人成纤维细胞对p21的反应中ROS水平增加。(A类)501T细胞感染含有p21的逆转录病毒并用嘌呤霉素筛选1周（p21），与载体感染细胞相比，表现出形态学变化和生长抑制（对照）。使用尼康Eclipse TE200显微镜（100×）拍摄细胞。(B类)在选择嘌呤霉素1周后，感染（I）逆转录病毒控制载体或（II）含有p21的细胞中的ROS水平。(C类)感染载体（I）或p21逆转录病毒（II）后，通过FACS分析测量501T细胞的细胞大小。
无
图3。NAC对EJp21细胞生长停滞/衰老表型的影响。(A类)EJp21细胞的活性氧水平（I）在四环素存在下，（II）在p21诱导5天后，（III）在添加10 mM NAC的p21诱导后5天后。免疫印迹分析显示这些细胞中p21的表达水平。(B类)在存在或不存在10mM NAC的情况下，通过tet去除5天诱导表达p21的EJp21细胞中SA-β-gal阳性细胞的百分比。在实验期间，对照细胞保存在tet中，没有NAC。结果表示两个独立度量的平均值，误差条表示标准偏差*P（P）<0.0001. (C类)集落形成试验的代表平板，其中最初平板为～100个细胞。细胞在没有tet的情况下维持0（对照组）、2、4或5天，然后将tet重新添加到培养基中。细胞再培养14天，然后进行10%福尔马林固定和Giemsa染色。(D类)上述每种情况下可回收菌落的百分比，标准化为对照板中的菌落数。从左到右，条形对应于控制板（黑色）和经10 mM处理的板N个-乙酰基-我-丙氨酸（浅灰色）、10 mM NAC（深灰色）或2 mM GSH（白色）。结果表示至少两个实验的平均值，误差条显示标准偏差。
无
图4。p16诱导对EJp16细胞生长停滞/衰老表型的影响。(A类)去除tet后不同时间段获得的EJp16细胞裂解物用抗p16抗体进行免疫印迹分析。(B类)去除tet后不同时间碘化丙啶染色后EJp16细胞的FACS分析。百分比表示G中被捕的细胞数量1细胞周期的阶段，由图形中的条分隔。(C类)通过FACS分析测量的在tet中培养的EJp16细胞（I）或去除tet 6天后的EJp16细胞（II）的细胞大小。(D类)荧光探针DCF染色后，通过FACS分析测量ROS水平。这些曲线对应于tet存在下培养的EJp16细胞（I）或tet去除后培养6天的细胞（II）。(E类)p16表达不同时间后的可恢复菌落百分比。EJp16细胞以每板100个细胞的密度进行培养，并在没有tet的情况下维持0（对照）至5天，然后添加tet。细胞再培养14天，然后进行10%福尔马林固定和Giemsa染色。黑条对应于不存在NAC的培养物的结果，灰条对应于10mM NAC的培养物的结果，标准化为对照板中的菌落数。结果代表三个实验的平均值，误差条显示标准偏差。(F类)菌落形成分析的代表性平板。
无
图5。不与PCNA结合的p21突变形式在EJ和正常人成纤维细胞中诱导永久性生长停滞和ROS。(A类)12.5%SDS–PAGE的放射自显影术，分离来自35转染HA-p21或HA-p21m构建物的293T细胞的S-代谢标记提取物。显示了分别与p21和PCNA大小对应的多肽。(B类)相同代谢标记提取物中PCNA和CDK2表达水平的免疫印迹分析。(C类)去除tet 2或5天后EJp21m细胞裂解物中p21表达水平的免疫印迹分析。(D类)EJp21m细胞在tet存在下培养（对照组）或去除tet 5天后培养（5d）。使用尼康Eclipse TE200显微镜（100×）拍摄细胞。(E类)通过去除tet 2（2d）或5（5d）天诱导表达突变p21的EJp21m细胞中SA-β-gal阳性细胞的百分比，与在tet存在下培养的细胞相比（对照）。结果表示三个独立度量的平均值，误差条显示标准偏差*P（P）<0.005; **P（P）<0.00001. (F类)与相同条件下EJp21细胞中的ROS水平相比，去除tet 2（2d）或5（5d）天后EJp21m细胞中的ROS水平。对照细胞在tet存在下培养*P（P）<0.05; **P（P）<0.001. (G公司)突变p21表达不同时间后的可恢复菌落百分比。EJp21m细胞以每板100个细胞的密度进行培养，并在没有tet的情况下维持0（对照）至5天，然后添加tet。细胞再培养14天，然后进行10%福尔马林固定和Giemsa染色。结果表示三个实验的平均值，标准化为控制板中的菌落数，误差条显示标准偏差*P（P）<0.00005; **P（P）<0.0005. (H（H）)用嘌呤霉素（p21m）筛选1周后，501T细胞感染了含有突变p21的逆转录病毒，与载体感染细胞相比，出现了形态学变化和生长抑制（对照）。使用尼康Eclipse TE200显微镜（100×）拍摄细胞。
无
图6。p21诱导活性氧的进一步分析。(A类)在tet存在下用EJp21细胞的p21抗体免疫染色2天（对照组），以及通过tet去除诱导p21 2（2d）或5（5d）天后。使用Nikon Microhot FXA显微镜（400×）对细胞进行拍照。(B类)PIG3由p21或突变体p21诱导，但不由p16诱导。与相同条件下EJp16中的水平相比，在四环素存在1或3天（+1d和+3d）和诱导1或3天后（-1d和-3d）对EJp21细胞中p21和PIG3 RNA水平进行Northern blot分析。外显子，诱导p21；内源性p21。
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