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.2002年5月；22(10):3425-36.
doi:10.1128/MCB.22.10.3425-3436.2002。

AMP活化激酶调节细胞质HuR

王文功 1, 金水扇, 杨晓玲, 斯蒂芬妮·福雷尔·加尔班, 伊莎贝尔·洛佩斯·德·西兰斯, 卡耶塔诺·冯·科布, 贾国, 史蒂夫·杰拉斯, 法比安·福菲勒, D格雷厄姆·哈迪, 戴维·卡林, Myriam Gorospe公司
附属公司

AMP活化激酶调节细胞质HuR

王文功等。 分子细胞生物学. 2002年5月.

摘要

虽然RNA结合蛋白HuR从细胞核到细胞质的转运是HuR功能的一个关键调节步骤，但这一过程的机制仍不清楚。在这里，我们报道了AMP-activated kinase（AMPK），一种参与代谢应激反应的酶，能够有效调节细胞质HuR的水平。通过细胞治疗或腺病毒感染抑制AMPK表达显性负性AMPK，可以提高细胞质中HuR的水平，增强HuR与p21、cyclin B1和cyclin A mRNA转录物的结合，提高其表达和半衰期。相反，AMPK的激活，通过感染来表达组成活性AMPK，导致细胞质HuR降低；编码p21、细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B1的mRNA水平和半衰期降低；并且减少了HuR与相应转录物的关联。因此，我们提出了AMPK作为细胞质HuR水平调节器的新功能，这反过来影响HuR的mRNA稳定功能和HuR靶转录物的表达。

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数字

图1。
图1。
RKO细胞中HuR的亚细胞定位。RKO细胞暴露于20-J/m后3小时2对UVC（lane UVC）或1 mM ATP（lane ATP）、全细胞（20μg）、核（10μg）和细胞质（40μg）裂解物进行Western blot分析，以监测HuR的表达。使用抗BAF57c和β-肌动蛋白抗体进行序列杂交，以分别评估分馏过程的质量以及核质和细胞质样品装载和转移的均匀性。Lane−，未经处理的裂解物。
图2。
图2。
用于评估不同处理对细胞质HuR水平的影响的方法。如图1图例所示，对未经处理或用AICAR处理的RKO细胞制备的全细胞、核和细胞质裂解物中的HuR丰度进行了Western blot分析。泳道−，未照射的细胞（对照）；车道UVC，UVC治疗。
图3。
图3。
通过增强细胞质中HuR存在的处理抑制RKO细胞中的AMPK激酶活性。RKO细胞暴露于20-J/m后3小时2制备UVC（lane UVC）或1 mM ATP（lane ATP）全细胞裂解物，用识别AMPKα1和α2亚单位的多克隆抗体，以合成肽SAMS为底物，在IP后检测AMPK激酶活性，未经处理的裂解物。
图4。
图4。
AMPK激活剂对HuR亚细胞定位的影响。所示为对RKO细胞制备的细胞质（40μg）和核（10μg）裂解物中AMPK活性（A）和HuR水平（B）的评估，这些裂解物是由血清饥饿36小时或用2 mM叠氮化钠、2 mM AICAR、1μM抗霉素A或1 mM ATP处理4小时的RKO电池制备的。对于Western blot分析，细胞要么接受模拟辐射，要么连续暴露于AMPK激活处理4小时（−），要么暴露于20-J/m2在添加AMPK激活剂6小时后的UVC，然后再培养3小时。（C）用AICAR、UVC或AICAR和UVC处理的RKO细胞中HuR的免疫荧光检测，如面板B图例所述。顶部，相控图像；中间，HuR免疫荧光；底部，Hoechst染色显示细胞核。
图5：。
图5：。
AMPK激酶活性动力学和HuR亚细胞定位。（A） 在用2 mM AICAR处理RKO细胞后的指定时间，评估AMPK活性（左）和细胞质中HuR的存在（右）。（B） 用AICAR处理RKO细胞指定时间后的FACS分析。（C） 用20-J/m剂量处理RKO细胞后，在指定时间评估细胞质中AMPK活性（左）和HuR的存在（右）2UVC。将蛋白质印迹（A和C）剥离并重新混合，以评估β-肌动蛋白水平，以控制样品装载和转移。
图6。
图6。
表达突变AMPK催化亚单位的腺病毒对AMPK激酶活性和细胞质HuR水平的影响。RKO细胞感染100 PFU的AdGFP、Ad（CA）AMPK或Ad（DN）AMPK/细胞48小时后，在未受辐射或暴露于UVC（20 J/m）的细胞质（40μg）和细胞核（10μg）部分细胞中测量AMPK活性（A）和HuR水平（B）2)3小时后采集。折叠，指示人群和AdGFP感染、未照射人群之间HuR信号的差异。在面板A中，数据表示四个独立实验的平均值±标准误差。（C） 感染后48小时RKO人群的FACS分析。
图7。
图7。
表达AMPK的腺病毒对HuR与靶转录物关联的影响。使用编码p21、细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B1基因的3′UTR的放射性标记RNA（见材料和方法）和RKO细胞的细胞质裂解物中存在的蛋白质进行EMSA，RKO细胞被AdGFP、Ad（CA）AMPK或Ad（DN）AMPK感染，然后暴露于20-J/m2紫外线或未照射的紫外线，3小时后收集。通过在存在抗HuR抗体（+HuR ab）或对照抗体（+p38 ab）的情况下监测超移带的形成来检测RNA-蛋白复合物中是否存在HuR。箭头，超位移复合物。折叠，显示细胞和AdGFP感染的未照射细胞之间放射性标记复合物总信号的差异。未计算超高速车道的折叠差异。f、 游离探针，不与细胞质裂解物孵育；高强度、超位移谱带在较高强度下形成。
图8。
图8。
AMPK调节剂对HuR与靶转录物关联的影响。EMSA是使用编码p21、cyclin A和cyclin B1基因和蛋白的3′UTR的放射标记转录物进行的，这些基因和蛋白存在于RKO细胞的细胞质裂解液中，这些细胞或用2 mM AICAR处理了指定的时间，然后未经照射或暴露于20-J/m2紫外线（+UVC）。通过监测抗HuR抗体（+HuR ab）存在下超转移带的形成来检测RNA-蛋白复合物中是否存在HuR。箭头，超移复合体。放射性标记复合物的相对信号与未经处理（−）、未受辐射细胞中测量的信号相比的折叠。未计算超高速车道的折叠差异。
图9：。
图9。
HuR与生物素化靶转录物形成复合物。在RKO细胞感染AdGFP、Ad（CA）AMPK或Ad（DN）AMPK48小时后制备的细胞质裂解物与与所示蛋白质编码基因的3′UTR相对应的生物素化转录物孵育。生物素化（Biot）RNA-蛋白复合物用链亲和素结合磁珠拉下，并通过Western blotting分析以评估HuR水平。所示下拉框是两个独立实验的代表。该图描述了蛋白质印迹上信号的定量。
图10。
图10。
AMPK调节干预影响HuR介导的mRNA稳定靶点的表达。（A） RKO细胞未经处理或用AICAR（2 mM）处理3或6 h，然后制备RNA并进行Northern blot分析，以评估编码p21、cyclin A和cyclin B1的mRNA的表达水平。（B） 上图，在腺病毒感染后的指定时间测量RKO细胞中编码p21、细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B1的mRNA水平。底部，定量mRNA水平，数据表示三个独立实验的平均值±标准误差。18S rRNA信号用于监测样品之间的装载和转移的均匀性。（C） 感染后48小时蛋白质表达的蛋白质印迹分析。
图11：。
图11：。
AMPK调节干预影响HuR稳定的mRNA的半衰期。（A） 在感染腺病毒48小时后，对RKO细胞中编码p21、细胞周期蛋白A、细胞周期素B1、细胞周期肽D1和β-肌动蛋白的mRNA的稳定性进行评估。（B） 用2μg ActD/ml处理细胞，在指定时间制备RNA，测量p21、cyclin A和cyclin B1 mRNA Northern印迹信号，将其标准化为18S rRNA信号，并将其绘制在对数刻度上（底部），计算mRNA半衰期。注意，细胞周期蛋白D1和β-肌动蛋白mRNA图的时间尺度不同。水平虚线，未处理细胞水平的50%。数据表示三个独立实验的平均值±标准误差。
图12：。
图12：。
AMPK对细胞增殖的影响。RKO细胞（每皿100000个细胞）感染100个PFU/细胞，此后每24小时用血细胞仪监测细胞数量。实验一式三份，数据为平均值±平均值标准误差。
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参考文献

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