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.2002年5月；22(10):3389-403.
doi:10.1128/MCB.22.10.3389-3403.2002。

MEK-细胞外信号调节激酶和MKK3/6-p38丝裂原活化蛋白激酶通路的顺序激活介导致癌ras诱导的早衰

王卫平 1, 琼·X·陈, 廖蓉（音）, 邓庆东, 詹妮弗·J·周, 双黄, 孙培青
附属公司

MEK-细胞外信号调节激酶和MKK3/6-p38丝裂原活化蛋白激酶通路的顺序激活介导致癌ras诱导的早衰

王卫平等。 分子细胞生物学. 2002年5月.

摘要

在原代哺乳动物细胞中，致癌ras依赖于活跃的MEK-细胞外信号调节激酶（ERK）有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径诱导过早衰老。目前尚不清楚ras激活有丝分裂MEK-ERK途径如何导致生长抑制。在本研究中，我们发现应激激活的MAPK，p38，在ras诱导的原代人成纤维细胞衰老开始时也被激活。活性MKK3或MKK6对p38的组成性激活可诱导衰老。当p38活性被抑制时，癌基因ras不能刺激衰老，这表明p38激活对ras诱导衰老至关重要。此外，我们已经证明，ras通过激活MEK-ERK通路刺激p38活性。在MEK和ERK激活后，致癌ras的表达导致活性MKK3/6和p38活化以MEK依赖的方式累积，随后诱导衰老。活性MEK1诱导相同的一组变化，并依赖活性p38引起衰老。因此，致癌ras通过依次激活正常原代细胞中的MEK-ERK和MKK3/6-p38通路，导致过早衰老。这些研究定义了ras信号级联中导致过早衰老的分子事件，从而为ras如何在原代细胞中引发致癌转化提供了新的见解。

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数字

图1。
图1。
致癌诱导早衰ras（拉斯维加斯）与p38激活相关。（A） 在PD20处用Ha-RasV12或载体控制转导的BJ细胞PD。数值为重复值的平均值±标准偏差。（B） 在选择后第7天对SA-β-gal（pH 6.0）进行染色后，用Ha-RasV12或载体对照转导的BJ细胞群的形态。（C） 用Ha-RasV12（Ras）或载体对照（BP）转导的BJ细胞进行Western blot分析，显示Ha-Ras、磷酸化ERK（P-ERK1/2）、ERK2、磷酸化p38（P-p38）、p38、磷酸化JNK（P-JNK）、JNK、p16的水平INK4A（墨水）和p53。（D） 用Ha-RasV12（Ras）或载体对照（BP）转导的BJ细胞中p38蛋白激酶活性，在激酶测定中在选择后第4天通过使用[γ-32P] 以ATP和GST-ATF2为底物，用抗p38抗体（αp38）或抗肌动蛋白抗体（αActin）免疫沉淀p38。所示为归一化为背景后磷酸化ATF2底物的相对量。用荧光成像仪对信号进行可视化和定量。
图2。
图2。
活性MKK3或MKK6激活p38可诱导过早衰老。（A） 利用载体控制（BP）或组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）对PD18转导的BJ细胞进行Western blot分析。MKK3、MKK6、磷酸-ERK（P-ERK1/2）、ERK2、磷酸-p38（P-p38）、p38、p16的水平INK4A（墨水）感染后10天检测p53。（B） 在PD18感染载体控制（BP）、Ha-RasV12（HaRasV12）、组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）或野生型p38α（p38αWT）后第7天至第11天BJ细胞的PD。数值为三倍的平均值±标准偏差（SD）。（C） 感染后第12天对SA-β-gal（pH 6.0）染色后，用载体控制（BP）或组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）转导的hTERT永生化的BJ细胞（BJ）或BJ细胞的形态。（D） 面板C中所示细胞群中SA-β-gal阳性细胞百分比的量化。数值为两个独立孔的平均值±SD。每个样本至少计数200个细胞。
图2。
图2。
活性MKK3或MKK6激活p38可诱导过早衰老。（A） 利用载体控制（BP）或组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）对PD18转导的BJ细胞进行Western blot分析。MKK3、MKK6、磷酸-ERK（P-ERK1/2）、ERK2、磷酸-p38（P-p38）、p38、p16的水平INK4A（墨水）感染后10天检测p53。（B） 在PD18感染载体控制（BP）、Ha-RasV12（HaRasV12）、组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）或野生型p38α（p38αWT）后第7天至第11天BJ细胞的PD。数值为三倍的平均值±标准偏差（SD）。（C） 感染后第12天对SA-β-gal（pH 6.0）染色后，用载体控制（BP）或组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）转导的hTERT永生化的BJ细胞（BJ）或BJ细胞的形态。（D） 图C所示细胞群中SA-β-gal阳性细胞百分比的量化。数值为两个独立孔的平均值±标准差。每个样本至少计数200个细胞。
图2。
图2。
活性MKK3或MKK6激活p38可诱导过早衰老。（A） 利用载体控制（BP）或组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）对PD18转导的BJ细胞进行Western blot分析。MKK3、MKK6、磷酸化ERK（P-ERK1/2）、ERK2、磷酸化p38（P-p38）、p38、p16的水平INK4A（墨水）感染后10天检测p53。（B） 在PD18感染载体控制（BP）、Ha-RasV12（HaRasV12）、组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）或野生型p38α（p38αWT）后第7天至第11天BJ细胞的PD。数值为三倍的平均值±标准偏差（SD）。（C） 感染后第12天对SA-β-gal（pH 6.0）染色后，用载体控制（BP）或组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）转导的hTERT永生化的BJ细胞（BJ）或BJ细胞的形态。（D） 面板C中所示细胞群中SA-β-gal阳性细胞百分比的量化。数值为两个独立孔的平均值±SD。每个样本至少计数200个细胞。
图3。
图3。
活性MKK3和MKK6上调16INK4A（墨水）mRNA水平。在用载体对照（BP）或编码活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MKK6E）的逆转录病毒转导后8天，从BJ细胞中分离总RNA。在琼脂糖凝胶上分离8微克RNA，转移到尼龙膜上，并与p16杂交INK4A（墨水）随机引物标记cDNA探针。用荧光成像仪对信号进行可视化和量化。数字代表p16的相对强度INK4A（墨水）信号归一化为背景信号和GAPDH信号后的信号（未显示数据）。
图4。
图4。
TNF-α诱导BJ细胞衰老。（A） 用所示浓度的TNF-α处理的BJ细胞（PD 24）的Western blot分析显示磷酸化JNK（P-JNK）、JNK1、磷酸化p38（P-p38）、p38和肌动蛋白水平。（B） 在PD32处用MEK1Q56P（MEK1）、Ha-RasV12（Ras）、载体控制（BP）或MKK6E转导BJ细胞，或用2μg TNF-α/ml处理BJ细胞后8天，测定其p38（P-ATF2）和JNK（P-c-Jun）激酶活性。从200μg（p38）或250μg（JNK）中分离并测定p38和JNK分别使用p38 MAP激酶检测试剂盒和SAPK/JNK MAP激酶分析试剂盒（细胞信号传导）检测细胞裂解产物。通过使用抗磷酸化-ATF2或磷酸化-c-Jun（c）的抗体，通过Western blot分析显示磷酸化底物，即p38的ATF2和JNK的c-Jun。用2μg TNF-α/ml或载体对照物处理的BJ细胞（PD 29）的PD。数值为三倍的平均值±标准偏差。（D） 在治疗第11天对SA-β-gal（pH6.0）进行染色后，用2μg TNF-α/ml（2）或载体对照（0）处理BJ细胞的形态。数字表示每个群体中SA-β-gal阳性细胞的百分比。
图5：。
图5：。
活性MKK7激活JNK不会诱导衰老。（A） 磷酸化JNK（P-JNK）、JNK1、磷酸化p38（P-p38）、p16的水平INK4A（墨水）用Ha-RasV12（HaRasV12）、组成活性MKK7（MKK7D）或载体对照（BP）转导PD 24的BJ细胞10天后，通过Western blot分析测定肌动蛋白。（B） BJ细胞PD在PD 24用Ha-RasV12（Ras）、组成活性MKK7（MKK7D）或载体控制（BP）转导。第0天表示感染后的第五天。数值为三倍的平均值±标准偏差。
图6。
图6。
p38激活的特异性抑制ras（拉斯维加斯）救援ras（拉斯维加斯）-诱导过早衰老。（A） 在含有载体对照物SB203580、U0126或U0126和SB203580.的情况下，在PD18时用载体对照物（BP）或Ha-RasV12（Ras）转导的BJ细胞PD。数值为三倍的平均值±标准偏差（SD）。（B） 在载体对照（Con）、SB203580（SB）、U0126（U）或U0126和SB203580（U+SB）存在下，用载体对照或Ha-RasV12在PD 18转导的细胞群中SA-β-gal阳性细胞的百分比。数值为三份的平均值±SD。（C） 在含有载体对照物（Con）、U0126（U）或SB203580（SB）的情况下，利用载体控制物（BP）或Ha-RasV12（HaRasV12）在PD18时转导的BJ细胞的Western blot分析，显示Ras、磷酸化ERK（P-ERK）、ERK和p16的水平INK4A（墨水）下图（P-Elk1融合）显示了在使用Elk1作为底物的体外激酶测定中测定的从相同细胞免疫沉淀的ERK的激酶活性。磷酸化底物通过Western blot分析和抗磷酸-Elk1抗体进行可视化。（D） p38β、p38γ和p38δ的显性负等位基因被挽救ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。表达p38β[p38β（AF）]、p38γ[p38γ（AF。从感染后第5天（指定为第0天）开始跟踪这些细胞的PD。数值为三份的平均值±SD。
图6。
图6。
p38激活的特异性抑制ras（拉斯维加斯）救援ras（拉斯维加斯）-诱导过早衰老。（A） 在含有载体对照物SB203580、U0126或U0126和SB203580.的情况下，在PD18时用载体对照物（BP）或Ha-RasV12（Ras）转导的BJ细胞PD。数值为三倍的平均值±标准偏差（SD）。（B） 在含有载体对照物（Con）、SB203580（SB）、U0126（U）或U0126和SB203580。数值为三份的平均值±SD。（C） 在含有载体对照物（Con）、U0126（U）或SB203580（SB）的情况下，利用载体控制物（BP）或Ha-RasV12（HaRasV12）在PD18时转导的BJ细胞的Western blot分析，显示Ras、磷酸化ERK（P-ERK）、ERK和p16的水平INK4A（墨水）底部面板（P-Elk1融合）显示了从相同细胞中免疫沉淀的ERK的激酶活性，如使用Elk1作为底物的体外激酶分析所测定的。磷酸化底物通过Western blot分析和抗磷酸-Elk1抗体进行可视化。（D） p38β、p38γ和p38δ的显性负等位基因被挽救ras（拉斯维加斯）-诱导衰老。表达p38β[p38β（AF）]、p38γ[p38γ（AF。从感染后第5天（指定为第0天）开始跟踪这些细胞的PD。数值为三份的平均值±SD。
图7。
图7。
p38不需要有丝分裂活性ras（拉斯维加斯）感染后三天，将在PD18转导带有载体控制（BP）或Ha-RasV12（Ras）的早期传代BJ细胞在载体控制或SB203580（SB）存在下置于低血清培养基中20 h，并用BrdU标记3 h。收集细胞，用FITC-结合抗BrdU抗体和碘化丙啶染色，并用双色流式细胞仪分析BrdU掺入和DNA含量。上框表示包含BrdU的单元（在S阶段），左下框表示G1单元格，右下框表示G2/M个单元格。BrdU阳性细胞的百分比被指示用于每个细胞群体。
图8。
图8。
p38激活方式ras（拉斯维加斯）由活跃的MEK-ERK途径介导。（A） 组成活性MEK1增加p38磷酸化。所示为选择后第6天用载体控制（BP）、Ha-RasV12（HaRasV12）或MEK1Q56P（MEK1Q56）转导的BJ细胞的Western blot分析结果，表明MEK1（MEK1）、磷酸化ERK（P-ERK1/2）、ERK2（ERK2）、磷酸酯酶p38（P-p38）、p38（p38）和p16的蛋白水平INK4A（墨水）（第16页）。（B） 阻止MEK-ERK活性抑制ras（拉斯维加斯）-诱导p38磷酸化。所示为感染后第10天，在存在载体对照（Con）、U0126（U）或SB203580（SB）的情况下，用载体对照（BP）、Ha-RasV12（HaRasV12）、MKK3E（MK3E）或MKK6E（MKK6E）转导的BJ细胞的Western blot分析结果，并显示磷酸化p38和p38水平。（C） 感染后第10天，在存在载体对照（Con）、U0126（U）或SB203580（SB）、组成活性MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E）或活性MEK1（MEK1Q56P）的情况下，在PD 30时用载体对照（BP）、Ha-RasV12（HaRasV12）转导的BJ细胞的p38免疫沉淀蛋白激酶活性。[γ-32P] 以ATP和GST-ATF2为底物。这些数字表示归一化到背景后磷酸化ATF2底物的相对数量。用荧光成像仪对信号进行可视化和量化。
图9：。
图9：。
MKK3/6通过致癌介导p38激活ras（拉斯维加斯）和激活的MEK1。（A） Ha-RasV12和MEK1Q56P诱导活性MKK3/6的积累，但对活性MKK 4的水平没有影响。磷酸-MKK3/6（P-MKK3/6）、肌动蛋白、磷酸-MKK4（P-MKK4）和MKK4的水平在用载体对照（BP）、致癌Ras（HaRasV12）或组成型活性MEK1（MEK1Q56P）在PD 33处转导BJ细胞10天后通过蛋白质印迹法测定。在用700 mM NaCl处理15分钟（NaCl）或不处理（−）的BJ细胞（PD 26）中，也测定了磷酸化MKK4（P-MKK5）和MKK3的水平。（B） Ha-RasV12和MEK1Q56P上调磷酸化MKK3/6依赖于MEK活性。在载体控制（BP）、Ha-RasV12（Ras）或MEK1Q56P（MEK1）、载体控制（Con）或U0126（U）存在的情况下，在PD39处转导BJ细胞7天后，通过Western blotting测定磷酸化MKK3/6（P-MKK6/6）和肌动蛋白的水平。（C） 致癌激活p38需要MKK3ras（拉斯维加斯）和激活的MEK1。在PD33处用Ha-RasV12（Ras）、MEK1Q56P（MEK1）或载体对照转导MKK3显性阴性等位基因（MKK3A）或表达载体对照（BH）的BJ细胞中，通过Western blot分析测定磷酸化p38（P-p38）和MKK2的水平。
图10。
图10。
MEK-ERK的激活先于MKK3/6-p38的激活和过早衰老。Ha-Ras、磷酸-MEK1和2（P-MEK1/2）、磷酸-ERK1和2中（P-ERK1/2），ERK2、磷酸-p38（P-p38）、p38、磷酸-MKK3和6（P-MKK3/6）、p16的水平INK4A（墨水）在PD35用载体控制（V）或Ha-RasV12（R）转导BJ细胞后的不同天（第3~9天）通过Western blotting测定肌动蛋白。在这些相同的细胞群中，SA-β-gal阳性细胞的百分比显示在底部。
图11：。
图11：。
Ha-RasV12-和MEK1Q56P-诱导的衰老都需要激活p38。显示了用Ha在PD 17转导的BJ细胞的生长曲线-rasV12型（Ha-RasV12）或组成活性MEK1（MEKQ56P）、MKK3（MKK3E）或MKK6（MK6E），在有车辆控制器、U0126（U）或SB203580（SB）的情况下。数值为选择后指定日期三次测定的平均值±标准偏差。
图12：。
图12：。
显示p38在致癌中作用的模型示意图ras（拉斯维加斯）-诱导原代成纤维细胞过早衰老。致癌激活Raf-MEK-ERK通路ras（拉斯维加斯）如先前发表的文献所述，通过转录因子AP-1促进细胞增殖，同时通过刺激p38通路的活性导致过早衰老，p38通路激活足以诱导p53和p16的积累INK4A（墨水）.
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