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.2002年4月2日；99(7):4319-24.
doi:10.1073/pnas.261702698。

FKBP12-雷帕霉素相关蛋白与线粒体相关并通过线粒体功能障碍感知渗透应激

比马尔N德赛 1, 本杰明·迈尔斯, 斯图亚特·施赖伯
附属公司

FKBP12-雷帕霉素相关蛋白与线粒体相关并通过线粒体功能障碍感知渗透应激

比马尔N德赛等。 美国国家科学院程序. .

摘要

FKBP12-雷帕霉素相关蛋白（FRAP，也称为mTOR或RAFT）是磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族的创始成员，是调节细胞生长的生理信号的传感器。FRAP整合的信号包括营养素、cAMP水平和渗透应激，受FRAP影响的细胞过程包括转录、翻译和自噬。FRAP整合这些不同信号的机制在很大程度上尚不清楚。最近，据报道，FRAP受到线粒体功能障碍和ATP水平耗竭的调节。在这里，我们表明，细胞暴露于高渗条件（以及葡萄糖缺乏的生长介质）会导致线粒体质子梯度的快速可逆消散。这些结果表明，FRAP介导渗透应激反应（和葡萄糖剥夺反应）的能力是通过中间线粒体功能障碍实现的。我们还发现，除了胞质FRAP外，FRAP的很大一部分与线粒体外膜相关。结果支持存在由线粒体和线粒体外膜相关FRAP组成的应激感受模块。该模块允许细胞整合各种影响线粒体功能的应激信号，并调节涉及p70 S6激酶的生长检查点。

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数字

图1
图1
线粒体功能障碍对p70S6K磷酸化反应的分析。(A类)显示了p70S6K磷酸转移对未经处理、30%氨基酸可用性（30%aa）、氨基酸缺乏（0%aa）和雷帕霉素处理以及增加叠氮化物剂量（1 mM、2 mM、5 mM、10 mM）的响应。还包括对磷酸化Akt和Akt的类似分析。(B类)雷帕霉素和羰基氰化物对p70S6K活性的影响第页-三氟甲氧基苯腙（FCCP）治疗。(C类)ΔNTΔCT-p70S6K雷帕霉素耐药等位基因对氨基酸和血清存在、血清退出、氨基酸和血清退出、雷帕霉素治疗和羰基氰化物的反应活性米-氯苯腙（CCCP）处理。(D类)通过JC-1分析，将雷帕霉素剂量引起的线粒体活性与CCCP处理的对照测量值进行比较。(E类)比较50 nM雷帕霉素治疗时间与CCCP处理的对照测量值的线粒体活性。
图2
图2
测量线粒体功能对高渗条件和葡萄糖缺乏的反应。(A类)将线粒体对暴露于渗透应激（600mM山梨醇处理）的时间的反应活性与CCCP处理进行比较。(B类)图中显示了线粒体对渗透胁迫水平（山梨醇%）的反应（黑色条）。在测量线粒体活性之前，用山梨醇处理Kit-225细胞30分钟。去除渗透压（山梨醇提取）20分钟后的线粒体活性显示为每个剂量的相邻条（灰色条）。(C类)葡萄糖缺乏引起的线粒体活动。Kit-225细胞暴露于指定条件下，并通过JC-1分析测定线粒体质子梯度。CM，完整媒体；GDM，葡萄糖缺乏培养基。
图3
图3
通过亚细胞分离研究分析FRAP免疫复合物和FRAP定位。(A类)FRAP免疫复合物中PDH复合物成分的鉴定。Jurkat细胞按照材料和方法用细胞裂解液通过抗FRAP多克隆抗体分离FRAP免疫复合物。考马斯染色凝胶显示使用模拟抗体（MOCK2）和FRAP免疫复合物（抗FRAP IP）获得的免疫复合物的分辨率。根据分子量标记FRAP免疫复合物中富集但模拟制剂中不存在的三条带。数字表示带的近似分子量。对标记为FIP70、FIP50和FIP36的条带进行微测序，以产生每个条带所示的肽序列。(B类)使用SDS/PAGE和FRAP和标记蛋白的免疫斑点对等量的指示组分进行解析。重膜颗粒中不存在HDAC1和p70S6K，表明该部分未被大量核蛋白或胞质蛋白污染。Calnexin主要是一种内质网（ER）驻留蛋白；它存在于重膜颗粒和囊泡部分中，这与重膜颗粒包含线粒体、溶酶体和ER滞留蛋白的事实一致。COX-1是一种线粒体标记物，因此主要见于重膜颗粒中。FRAP存在于重膜颗粒和细胞溶质部分。(C类)分析未经处理和雷帕霉素处理的细胞的重膜颗粒（HMmbP）和细胞溶质（Cyt/S-100）组分的FRAP和标记蛋白水平的变化。分析中还包括一个额外的线粒体标记（Bcl-2）。(D类)使用蔗糖梯度（SG-MTCND）纯化的线粒体部分和未经处理和雷帕霉素处理的细胞的细胞溶质部分分析FRAP的存在。
图4
图4
3T3细胞FRAP的免疫荧光共聚焦显微镜和免疫电子显微镜。(A类)共焦显微镜显示FRAP和线粒体的共聚焦。在固定和通透性之前，用MTR对线粒体进行染色。COX-1主要用抗COX-1单克隆抗体染色，FRAP主要用抗FRAP单克隆抗体着色，c-myc主要用抗c-myc单克隆抗体染。使用[Alexa-fluor-488]结合抗体作为二次染色。叠加框架中的黄色斑点表示colocolization。COX-1显示完全共定位（方法学阳性对照），而c-Myc不与线粒体共定位（法学阴性对照）。FRAP的很大一部分与线粒体共定位(B类免疫电镜显示FRAP的线粒体定位。用链霉亲和素金二次染色法检测一级抗FRAP单克隆抗体。箭头指向盒子内的电子密集型二次探针。在C类长箭头指向典型的高频率膜近端定位。（放大倍数：×15000。）
图5
图5
FRAPm对蛋白酶处理和碱提取的敏感性。(A类)对有或无蛋白酶K处理（20分钟，室温）的线粒体制备进行解析，并对FRAP和线粒体标记物（COX-1和Bcl-2）进行免疫标记。COX-1与内膜相关，因此对蛋白酶K处理不敏感。Bcl-2与外膜相关并暴露在外，因此对蛋白酶处理敏感。FRAP对蛋白酶处理也很敏感。(B类)对线粒体制剂的等渗和碱提取进行了分析。对这些提取物的不溶性颗粒（P）和上清液（S）进行了解析，并对FRAP和标记蛋白进行了探测。
图6
图6
说明FRAP在感知线粒体功能障碍和调节p70S6K中作用的模型。该模型强调了FRAP在通过中间线粒体功能障碍感应高渗和葡萄糖剥夺条件引发的信号中的作用。其他导致线粒体功能障碍的应激信号，如缺氧，也可能通过使用类似的机制向FRAP发出信号。FRAP通过一种独立于线粒体的机制感知氨基酸剥夺。两种不同的途径协调p70S6K的调节：(我)由有丝分裂原或生长因子启动并与“次级磷酸酶”平衡的激酶导向途径(ii（ii）)FRAP介导的途径，涉及一种“显性磷酸酶”（PP2A亚型），通过p70S6K的N末端结构域（NTD）与wt-p70S6K构成关联。p70S6K的雷帕霉素耐药等位基因NTCT-p70S6K在NTD和C末端结构域（CTD）被截断。显性磷酸酶不能与NTCT-p70S6K相关，因此FRAP介导的信号不会影响NTCT-p70 S6K。FRAP感知线粒体功能的潜在机制显示为“放大”(赖特). FRAP与线粒体PTP有关，PTP由VDAC和ANT组成。PDH复合体（位于线粒体基质中）与PTP非常接近，在PTP处可以接收糖酵解物衍生的丙酮酸，丙酮酸主要通过PTP进入线粒体。
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