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.2002年4月1日；30（7）：e30。
doi:10.1093/nar/30.7.e30。

Motorola CodeLink微阵列在基因表达谱应用中的性能评估

拉梅什·拉马克里希南 1, 大卫·多利斯, 安娜·卢布林斯基, 阿伦·阮, 马克·多马努斯, 安娜·普罗霍罗娃, 林恩·吉瑟, 爱德华·图马, 兰德尔·洛克纳, 穆西·塔塔, 朱晓梅, 马库斯·帕特森, 理查德·希皮, 蒂莫西·森德拉, Abhijit Mazumder公司
附属公司

Motorola CodeLink微阵列在基因表达谱应用中的性能评估

拉梅什·拉马克里希南等。 核酸研究. .

摘要

DNA微阵列使用户能够在大规模平行尺度上获得转录物丰度差异的信息。然而，最近的数据分析揭示了与图像采集、重复测量中的变异性和错误分类、交叉杂交和灵敏度限制相关的潜在缺陷。我们已经生成了一系列分析工具，用于处理微阵列实验的制造、检测和数据分析组件。我们一起使用这些工具来优化表达式分析研究中的性能。我们展示了Motorola CodeLink平台的三个显著优势：每个细胞一个拷贝的敏感性，跨载玻片和跨靶制剂杂交信号10%的变异系数，以及区分高度同源序列的特异性。使用6倍冗余的寡核苷酸探针幻灯片来证明复制对数据质量的影响。最后，通过CodeLink表达平台获得的差异表达率与通过54个基因的定量逆转录PCR分析获得的差异表示率进行了验证。

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数字

图1
图1
探针浓度芯片：杂交强度与探针和靶浓度的关系。平均IOD绘制为七种不同探针分配浓度下目标RNA浓度的函数。误差线表示一个标准偏差。
图2
图2
生物素化探针芯片：检测过程的线性、可变性、灵敏度和局部背景均匀性。(A类)用链霉亲和素-Alexa 647处理幻灯片，并在500（蓝线）、600（粉线）和700（红线）的PMT电压下进行扫描。每个数据点表示每个载玻片平均16次重复。(B类)在PMT电压为500（粉红色线）、600（红色线）和700（蓝色线）时，用链霉亲和素-Alexa 532（浅绿色线）、TSA（深绿色线）或链霉亲和素-Alexa 647扫描幻灯片。本地背景由幻灯片上每个点的两像素中值表示。(C类)用链霉亲和素-Alexa 647（黄线）、链霉亲和素-cy3（黑线）或链霉亲和力蛋白-藻红蛋白（粉线）处理载玻片，并在600的PMT电压下进行扫描。
图2
图2
生物素化探针芯片：检测过程的线性、可变性、灵敏度和局部背景均匀性。(A类)用链霉亲和素-Alexa 647处理幻灯片，并在500（蓝线）、600（粉线）和700（红线）的PMT电压下进行扫描。每个数据点表示每个载玻片平均16次重复。(B类)在PMT电压为500（粉红色线）、600（红色线）和700（蓝色线）时，用链霉亲和素-Alexa 532（浅绿色线）、TSA（深绿色线）或链霉亲和素-Alexa 647扫描幻灯片。本地背景由幻灯片上每个点的两像素中值表示。(C类)用链霉亲和素-Alexa 647（黄线）、链霉亲和素-cy3（黑线）或链霉亲和力蛋白-藻红蛋白（粉线）处理载玻片，并在600的PMT电压下进行扫描。
图3
图3
负控制阈值可用于定义检测下限。(A类)图中显示了用于计算阈值的阴性对照探针的平均IOD。每个幻灯片有216个阴性对照探头（54个探头，4×冗余）。使用每个滑块20%的修剪平均值计算阈值（从探针群中去除10%的最高信号和10%的最低信号），其余探针用于计算阈值。在未修剪的人群中，9.44%的阴性对照探针高于阈值。该线表示由平均值和三个标准偏差计算的阈值。(B类)在六个不同的样本中，阴性对照值是恒定的。计算六个组织的平均（星号）和中间（圆圈）阴性对照值（每个组织杂交两次）。
图4
图4
(A类–D类)灵敏度和动态范围。将九个外源性细菌转录物添加到人类肝脏的复合mRNA中，每个转录物的浓度都在增加[细菌RNA：总人类肝脏RNA为1:6000、1:20 000、1:60 000、1:600 000、1:30 000、1:6 000 000 in（A）和（B），以及1:30 000 000、1:6000 000、1:9 000 000和1:15 000 000 in，（C）和（D）]。通过将每个细菌阳性对照探针的荧光除以阴性对照阈值来确定信号阈值比。的数据阿拉伯的（A） 和gnd（接地）（B） 显示成绩单。在每种情况下，都有三个细菌控制探针设计用于与每个转录本杂交。(E类和F类)杂交过程中混合的影响。（E） 平均信号强度(x个-轴）和不带(年-轴）对所有探针（约9300个）绘制混合图。弓形图显示了混合时增强的信号强度。（F） 24个阳性细菌控制探针的信号强度(x个轴），当它们的互补转录物以1:2 000 000的质量比加入总RNA时。每对中的第一条代表通过混合获得的信号强度，每对中第二条代表在没有混合的情况下获得的信号密度。
图4
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(A类–D类)灵敏度和动态范围。将九个外源性细菌转录物添加到人类肝脏的复合mRNA中，每个转录物的浓度都在增加[细菌RNA：总人类肝脏RNA为1:6000、1:20 000、1:60 000、1:600 000、1:30 000、1:6 000 000 in（A）和（B），以及1:30 000 000、1:6000 000、1:9 000 000和1:15 000 000 in，（C）和（D）]。通过将每个细菌阳性对照探针的荧光除以阴性对照阈值来确定信号阈值比。的数据阿拉伯的（A） 和gnd（接地）（B） 显示成绩单。在每种情况下，都有三个细菌控制探针设计用于与每个转录本杂交。(E类和F类)杂交过程中混合的影响。（E） 平均信号强度(x个-轴）和不带(年-轴）对所有探针（约9300个）绘制混合图。弓形图显示了混合时增强的信号强度。（F） 24个阳性细菌控制探针的信号强度(x个轴），当它们的互补转录物以1:2 000 000的质量比加入总RNA时。每对中的第一条代表通过混合获得的信号强度，每对中第二条代表在没有混合的情况下获得的信号密度。
图4
图4
(A类–D类)灵敏度和动态范围。将九个外源性细菌转录物添加到人类肝脏的复合mRNA中，每个转录物的浓度都在增加[细菌RNA：总人类肝脏RNA为1:6000、1:20 000、1:60 000、1:600 000、1:30 000、1:6 000 000 in（A）和（B），以及1:30 000 000、1:6000 000、1:9 000 000和1:15 000 000 in，（C）和（D）]。通过将每个细菌阳性对照探针的荧光除以阴性对照阈值来确定信号阈值比。的数据阿拉伯的（A） 和gnd（接地）（B） 显示成绩单。在每种情况下，都有三个细菌控制探针设计用于与每个转录本杂交。(E类和F类)杂交过程中混合的影响。（E） 平均信号强度(x个-轴）和不带(年-轴）对所有探针（约9300个）绘制混合图。弓形图显示了混合时增强的信号强度。（F） 24个阳性细菌控制探针的信号强度(x个轴），当它们的互补转录物以1:2 000 000的质量比加入总RNA时。每对中的第一条代表通过混合获得的信号强度，每对中第二条代表在没有混合的情况下获得的信号密度。
图5
图5
CodeLink™Expression Bioarray平台的特异性。通过在探针中间引入一个（1×）、两个（2×）、三个（3×）或四个（4×）相邻失配，并测定与完全匹配（无失配）及其每个失配探针相关的荧光，来确定特异性。在与人类肝脏总RNA产生的cRNA杂交后，对五组探针进行了分析。每个错配探针在玻片上有四个重复。该线表示阈值。
图6
图6
CodeLink™Expression Bioarray平台的可变性。(A类)将胎盘和六张载玻片产生的三个靶点准备之间的归一化杂交信号的变异性（CV）绘制为平均归一化强度的函数。图中显示了代表50个探针移动平均值的趋势线。(B类)差异表达比率的可变性。在检测心脏和胎盘的实验中，差异表达率的CV是比率自然对数的函数。
图7
图7
复制对数据质量的影响。(A类)使用高冗余芯片，每个探针杂交信号中的CV是通过在三张幻灯片上的每张幻灯片上取一个数据点来计算的，或者首先对幻灯片上的两个或多个数据点求平均值，然后计算三张幻灯片的CV。然后使用每张幻灯片中的不同数据点或一组数据点重复该计算五次，以获得总共六个CV，然后对其进行平均，以获得每个探针的一个CV值。请注意，这一迭代过程不可能在一张幻灯片中重复六次。通过确定1146个探针中每个探针的CV，并对所有这些数字进行平均，以生成一个数字，从而计算出整体平均CV。因此，对于幻灯片中的一到五个重复，全局平均CV是六个组合/探针×1146探针=7876 CV的平均值。然后绘制整体平均CV，作为玻片内探针重复次数的函数。(B类)进行了（A）中所示的相同分析，但计算中只使用了三个探针。一个探针代表低表达者（星号），一个探针表示中等表达者（圆圈），另一个探针则代表高表达者（三角形）。然后绘制单个探针的平均CV（六个CV的平均值），作为玻片内探针重复次数的函数。(C类)错误分类的数量（假阳性和假阴性）被绘制为幻灯片内重复次数的函数。再次检查了三个载玻片的杂交信号。如果特定载玻片上的杂交信号是探针中值的2倍以上，则使用术语错误分类。与（A）中一样，载玻片内一到五次重复的数据点总数为7876个。六种不同比较中产生的离群值总数（在每张幻灯片中取六个不同的数据点或数据点集）除以7876，生成年-轴值。
图8
图8
差异表达率与TaqMan的相关性®用TaqMan获得的差异表达率的log2®将心脏和大脑进行比较时绘制在年-轴与CodeLink™Expression Bioarray平台使用相同RNA在x个-轴。相关系数(对=0.76）基于所有54个基因。
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引用人

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工具书类

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