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.2002年3月15日；16(6):707-19.
doi:10.1101/gad.970902。

酵母蛋白质组的亚细胞定位

阿努杰·库马尔 1, 西玛·阿加瓦尔, 约翰·A·海曼, 桑德拉·马特森, 马修·海德曼, 斯泰西·皮奇里略, 劳拉·乌曼斯基, 阿马尔·德拉维德, 罗纳德·詹森, 杨柳, Kei-Hoi Cheung先生, 佩里·米勒, 马克·格斯坦, G雪琳·罗德, 迈克尔·斯奈德
附属公司

酵母蛋白质组的亚细胞定位

阿努杰·库马尔等。 基因开发. .

摘要

蛋白质定位数据是有助于阐明真核蛋白质功能的宝贵信息资源。在这里，我们报道了第一次对真核生物中蛋白质定位的蛋白质组学分析。使用定向拓扑异构酶I介导的克隆策略和全基因组转座子突变，我们获得了60%的酿酒酵母蛋白质组表位标记。通过标记基因产物的高通量免疫定位，我们确定了2744个酵母蛋白的亚细胞定位。通过使用贝叶斯形式主义的计算算法外推这些数据，我们定义了酵母局部组（所有6100个酵母蛋白的亚细胞分布）。我们估计酵母蛋白质组包含大约5100个可溶性蛋白质和>1000个跨膜蛋白质。我们的结果表明，47%的酵母蛋白质是细胞质，13%是线粒体，13%是外细胞（包括内质网和分泌囊泡的蛋白质），27%是核仁/核仁。通过使用减数分裂染色体的表面扩散制备物进行免疫定位，进一步分析核蛋白的子集。在这些蛋白质中，38%与染色体DNA相关。根据核蛋白的表型分析确定，34%对孢子活力至关重要，这一百分比几乎是整个蛋白质组的两倍。总的来说，这项研究提供了955个以前功能未知的蛋白质的实验衍生定位数据：酵母中几乎一半的功能未特征化蛋白质。为了方便访问这些数据，我们提供了一个可搜索的数据库，其中包含2900张荧光显微照片，网址为http://ygac.med.yale.edu。

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数字

图1
图1
全基因组表位标记策略。(A类)通过PCR扩增酵母ORF，并通过拓扑异构酶I介导的连接将其克隆到酵母表达载体pYES2/GS中。pYES2/GS载体携带酵母2μ复制源，以维持高拷贝数。将酵母基因插入pYES2中，使其处于镀锌1启动子并在其3′端融合到编码V5肽和多组氨酸标签（HIS）的序列6通过在酵母中的半乳糖诱导，克隆的基因被过表达为V5标记的蛋白质，用于随后的α-V5抗体的免疫定位（96孔形式）。(B类)使用改良的细菌转座子在酵母基因的天然基因组位点随机标记酵母基因，序列编码病毒血凝素表位（3×HA表位）的三个拷贝。转座子携带无启动子和5′-截断的lacZ公司通过β-半乳糖苷酶分析选择框架内插入物的报告人。随后Cre在酵母中修改了框架内插入物-lox公司重组，使大多数转座子序列被切除。剩余的HA-epitope插入元素（HAT标记）在指定的读取帧中不编码停止码。所示的279-bp HAT标签插入包括与Tn相关的靶位点序列中的5 bp重复三换位。HAT标记的蛋白用96-well格式的单克隆α-HA抗体进行免疫定位。
图2
图2
表位标记蛋白的免疫定位。(A类–E类)含有HAT标记蛋白的营养细胞用DNA结合染料4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；左边图像）和抗HA的单克隆抗体(中心). 每行，DAPI染色和α-HA染色的图像合并显示在最右侧的面板中。在含有rRNA-结合蛋白Net1p的HAT标记等位基因的菌株中可以看到典型的核仁染色模式(A类)和Sik1p(E类). 含有HAT标记的Hsl1p的细胞的细胞颈染色明显(B类). 空泡ATP酶Vma6p的HAT标记如行所示C类。细胞表面糖蛋白Gas1p的HAT标记可以看到细胞外围的染色(D类). (F类–J型)携带V5标记蛋白的营养细胞用针对V5表位的单克隆抗体染色(中心). 相应的DAPI静态图像和合并图像分别显示在左侧和右侧。携带V5标记的Nop13p的细胞出现明显的核仁染色(F类). 然而，请注意，V5标记和轻度过度表达SIK1系列(J型)结果出现了核染色模式，与此相同基因的HAT标记上明显的核仁模式相反(E类). 线粒体染色(G公司)可以在携带标记的等位基因的细胞中看到293C年; DAPI染色和α-V5染色之间的重叠显示在合并图像中。V5标记的Gpi12p定位于内质网(小时)核边缘周围可见强染色区。携带V5标记的Bzz1p的细胞中可见斑片状的细胞质染色(我). 棒，2μm。
图3
图3
酵母蛋白质组的亚细胞划分。(A类)细胞隔室如下：细胞质（Cyt.）、核（Nuc.）、线粒体（Mit.）和外胚层（Exo.）。每个隔间的膜分数用条纹表示。图表外显示了各个膜和每个隔室的可溶部分中包含的酵母蛋白质组的百分比；图表中显示了四个主要腔室中每个腔室所含蛋白质组的总百分比。为了进行此分析，细胞质室中包括质膜蛋白。(B类)显示了每个细胞室和膜/可溶性亚组分的相应蛋白质群体。
图4
图4
核蛋白在表面扩散的减数分裂染色体上的免疫定位。减数分裂染色体表面铺展并用DNA结合染料DAPI染色(左边)和单克隆抗HA抗体(中心). 相应的合并图像显示在右侧。染色体结合的一般模式可以从含有HAT标记的等位基因的细胞的免疫荧光分析中看出重油催化裂化3(A类–C类),国际奥委会2(D类–F类)，以及PDR1型(G公司–我). 9种主要定位于核仁的蛋白质；典型的核仁染色模式显示在含有HAT标记的等位基因的细胞中YGR090W型(J型–L（左）),MPP10（MPP10）(米–哦)，以及1996年1月(P（P）–对). 通过HAT标记和起源识别复合物亚基Orc4p的免疫定位可以看到与端粒DNA的特异性结合(S公司–U型). 棒材，1μm。
图5
图5
核蛋白的染色体定位和表型分析。染色体定位显示了染色体结合的一般模式，通常每个细胞核有>40个染色病灶。对每个基因被破坏的菌株进行孢子活力或生长缺陷检测；相应地，观察到的破坏突变体被分为存活、不可见或生长缓慢。
图6
图6
与酵母细胞隔室相关的常见功能。从MIPS CYG数据库中提取本研究中实验定位的所有蛋白质的功能分类（根据已发表的文献汇编）。总的来说，1789个蛋白质具有功能；显示了定位于每个所示细胞隔室的功能分类蛋白质的数量。混合定位也有代表性：165个功能特征蛋白共定位于细胞质和细胞核；类似地，61个这样的蛋白与细胞质和内质网（ER）共定位。计算了给定细胞间隔内所有蛋白质的功能。每个隔间最常见的功能显示在方框中。单一蛋白质可能具有多种功能。因此，每个功能后列出的百分比是指与特定细胞过程相关的每个细胞室内蛋白质的比例，而给定细胞室内这些百分比的总和将不等于100%。
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