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.2002年4月；22(8):2799-809.
doi:10.1128/MCB.22.82799-2809.2002。

Akt/蛋白激酶B促进转基因小鼠器官生长

Tetsuo Shioi公司 1, 朱莉·麦克马伦, 彼得·M·康, 帕梅拉·道格拉斯, Toshiyuki Obata公司, 托马斯·弗兰克, 刘易斯·坎特利, 井冈精工（Seigo Izumo）
附属公司

Akt/蛋白激酶B促进转基因小鼠器官生长

Tetsuo Shioi公司等。 分子细胞生物学. 2002年4月.

摘要

生物学中最不为人所知的领域之一是确定动物及其器官的大小。在果蝇中，胰岛素受体磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）途径的成分决定身体、器官和细胞大小。一些生物化学研究表明，Akt/蛋白激酶B是PI3K的重要下游靶点之一。为了研究Akt在哺乳动物器官大小调节中的作用，我们制作了转基因小鼠，并对其进行了表征，这些转基因小鼠在心脏中特异性表达组成活性Akt（caAkt）或激酶缺乏型Akt。与非转基因小鼠相比，caAkt转基因小鼠的心脏重量增加了2.0倍。在caAkt小鼠中，心脏大小的增加与心肌细胞大小的相应增加有关。kdAkt突变蛋白减弱了组成活性PI3K诱导的心脏过度生长，而caAkt突变体蛋白绕过了激酶缺陷型PI3K突变蛋白诱导的心脏生长迟缓。雷帕霉素减弱了caAkt诱导的心脏过度生长，表明雷帕霉素的哺乳动物靶点或mTOR的效应器介导了caAkt诱导的心脏生长。总之，Akt足以诱导心脏尺寸显著增加，并可能是PI3K途径介导心脏生长的效应器之一。

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数字

图1。
图1。
Akt转基因小鼠的产生。（A） 转基因表达。为了比较转基因和内源性Akt的数量，用SDS-PAGE分离来自caAkt或kdAkt转基因小鼠的1、10和100μg心脏组织裂解物和来自NTg小鼠的100μg蛋白质，并用抗Akt抗体进行检测。（B） 转基因心脏中的Akt活性。免疫沉淀1毫克心脏组织裂解物，并通过体外激酶测定法测量激酶活性。kdAkt转基因小鼠或NTg小鼠注射生理盐水或每公斤0.5毫克IGF1，持续5分钟以激活Akt。每组代表三个或四个心脏。caAkt小鼠心脏组织中的总Akt活性显著增加。在基础和IGF1刺激条件下，kdAkt小鼠的Akt活性均显著降低。符号：*，P（P）与盐水注射NTg小鼠相比<0.05；†，P（P）与注射IGF1的NTg小鼠相比，<0.05。
图2。
图2。
在Akt转基因小鼠心脏中激活GSK-3β和S6K1。（A） Akt转基因小鼠心脏组织中GSK-3β的磷酸化。免疫沉淀GSK-3β，并用抗磷酸化GSK-3（Ser9）抗体（顶部）或抗GSK-3抗体（中部）进行检测。在caAkt小鼠中，磷酸化GSK-3β归一化为总GSK-3α的量与NTg小鼠中没有差异。与NTg小鼠相比，kdAkt小鼠中磷酸化GSK-3β归一化为GSK-3总β的量显著减少（底部）。（B） Akt转基因小鼠心脏组织中的S6K1活性。使用GST-S6作为底物（顶部），通过免疫复合物激酶分析测定S6K1活性。免疫沉淀（IP）S6K1的数量通过Western blotting（中）进行分析。S6K1活性归一化为总S6K1，在caAkt小鼠的心脏中升高，在kdAkt鼠的心脏中降低（下图）。从kdAkt小鼠中获得了快速迁移带，这表明S6K1磷酸化程度较低（中间，*）。（C） Akt转基因小鼠心脏组织中核糖体S6蛋白的磷酸化。使用抗磷酸-S6抗体（top）通过Western blotting检测核糖体S6蛋白的磷酸化。将蛋白质负载量标准化为GAPDH的量（中间）。在caAkt小鼠中，磷酸化S6的量标准化为GAPDH，增加了1.8倍，而在kdAkt鼠中，其减少到NTg小鼠的36%（底部）。每组代表四颗心。*，P（P）与NTg小鼠相比<0.05。
图3。
图3。
kdAkt转基因小鼠的PKCζ活性。使用合成肽作为底物（顶部），通过体外激酶试验测量NTg小鼠或kdAkt转基因小鼠心脏组织中的PKCζ活性。从1mg的心脏组织裂解物中免疫沉淀PKCζ。GST-PKCζ被用作激酶分析的阳性对照。kdAkt转基因小鼠心脏中PKCζ活性与NTg小鼠心脏中没有差异。每组代表三颗心。用SDS-PAGE分离免疫沉淀（IP）PKCζ或GST-PKCξ，将其印在PVDF膜上，并用抗PKCζ的抗体进行探测（底部）。
图4。
图4。
Akt转基因小鼠的病理分析。（A） Akt转基因小鼠的宏观病理学分析。在caAkt小鼠中，所有心室的大小和心室壁厚度都显著增加。保持了腔室大小的比例。在kdAkt小鼠中，心脏大小与NTg小鼠没有差异。横条表示1 mm。（B）Akt转基因小鼠的组织病理学分析。caAkt小鼠心肌细胞明显肥大。还观察到广泛的间质纤维化（马森三色染色呈蓝色）。kdAkt小鼠的组织学正常。H&E、苏木精和曙红染色；三色，马森三色染色。棒材代表10μm。
图5：。
图5：。
Akt转基因小鼠细胞大小分析。用分离的成年心肌细胞测定心肌细胞大小。每只小鼠的平均值是通过使用从该小鼠分离的100个细胞的测量值来计算的。接下来，根据单个小鼠的平均值计算每个实验组的平均值（±SE），并给出该值。在caAkt转基因小鼠中，细胞体积增加了1.9倍±0.2倍。n、 检查的心脏数量。
图6。
图6。
PI3K和Akt在器官大小调节中的遗传互作。（A） 表达caPI3K和kdAkt转基因的双转基因小鼠的HW/BW比值显著低于caPI3K小鼠（1.10±0.01对1.22±0.03；P（P）= 0.0096; NTg小鼠=1.00）。（B） 同时含有kdPI3K和caAkt的双转基因小鼠的HW/BW比率与caAkt-小鼠相似（2.24±0.08对2.31±0.25；P（P）= 0.7438; NTg小鼠=1.00）。n、 小鼠数量。符号：*，P（P）<0.05与NTg小鼠相比：†，P（P）<0.05与caPI3K小鼠；#，P（P）与kdPI3K小鼠相比<0.05。
图7。
图7。
雷帕霉素对caAkt小鼠S6K1活性的影响。NTg小鼠或caAkt小鼠用载体（V）或雷帕霉素（R）治疗。以GST-S6为底物（顶部），通过免疫复合物激酶分析测定心脏组织中S6K1的活性。免疫沉淀（IP）S6K1的数量通过Western blotting（中）进行分析。S6K1活性/S6K1蛋白质比率显示在底部。每组代表四只小鼠。与车用NTg小鼠的心脏相比，车用caAkt小鼠的心脏中S6K1活性增加。雷帕霉素显著降低NTg小鼠心脏中S6K1的活性。雷帕霉素处理的caAkt小鼠心脏中的S6K1活性与雷帕霉素治疗的NTg小鼠心脏中S6K1的活性相当。符号：*，P（P）与车用NTg小鼠相比<0.05；†，P（P）与相同基因型的车用小鼠相比，<0.05。IgG（H），免疫球蛋白重链。
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参考文献

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