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.2002年3月；76（6）：2730-8。
doi:10.128/jvi.76.6.2730-2738.2002。

重组水疱性口炎病毒疫苗产生的高水平初级CD8（+）T细胞对人类免疫缺陷病毒1型gag和env的反应

卡尔·哈格隆德 1, 英格丽德·莱纳, 克里斯汀·柯克西克, 琳达·博诺科尔（Linda Buonocore）, 埃里克·帕默, 约翰·K·罗斯
附属公司

重组水疱性口炎病毒疫苗产生的高水平初级CD8（+）T细胞对人类免疫缺陷病毒1型gag和env的反应

卡尔·哈格隆德等。 J维罗尔. 2002年3月.

摘要

我们研究了重组水疱性口炎病毒（rVSV）诱导的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）Env和Gag蛋白的主要细胞免疫反应。腹腔接种后5至7天，对Env的主要反应达到高峰，此时40%的CD8（+）细胞呈Env四聚体阳性并被激活（CD62L（Lo））。这些新分离的细胞主动裂解p18-I10肽脉冲作用的靶细胞，并在Env p18-I1肽刺激后分泌γ-干扰素和肿瘤坏死因子α。接种后5天，rVSV对Env的主要反应是重组痘苗病毒（rVVs）的6倍。鼻内接种VSV-Env也会引起对Env的强烈初级反应。rVSV对Gag的初级免疫应答在接种后7天达到高峰，此时3%的CD8（+）细胞Gag四聚体阳性，CD62L（Lo）细胞胞内细胞因子染色显示有功能。这种反应比表达rVV的Gag引起的反应高出八倍。VSV GagEnv从单个重组物中同时表达Gag和Env，也诱导了对Env和Gag的强烈细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。我们的定量分析说明了VSV载体系统在CTL诱导中的效力。

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数字

图1。
图1。
VSV/HIV重组体和感染细胞中的蛋白表达示意图。（A） VSV-rwt和三个VSV/HIV重组体的基因组在负链病毒RNA上以3′-5′方向绘制。其他基因通过复制保守的VSV转录开始和停止信号来表达（42）。VSV-Gag和VSV-Env表示堵住基因和IIIb环境价值基因分别位于VSV的G和L基因之间。VSV-GagEnv包含堵住和环境价值单个重组体中的基因。（B） 显示rVSV感染细胞中VSV和HIV蛋白表达的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。BHK细胞感染了MOI为10到20的重组体。4小时后，用不含蛋氨酸的培养基替换培养基[35S] 蛋氨酸。1小时后对细胞进行裂解，并通过SDS-PAGE对提取物进行分级。此处显示的样品在VSV N蛋白含量归一化后进行再矿化。
图2。
图2。
VSV-Env疫苗接种后对Env主要反应的MHC I类四聚体定量。（A） 接种5×10疫苗后5天6VSV-Env的PFU(n个=3）或VSV-rwt(n个=2），从接种BALB/c小鼠中分离出大量脾细胞，并用Env四聚体、抗CD8和抗CD62L抗体进行染色。收集流式细胞术数据，仅收集活CD8+分析中包括淋巴细胞。左上象限显示CD8的百分比+Env四聚体阳性细胞和CD62LLo（低）（B）按照上述方法接种小鼠，并在接种后3至15天内每隔2天检查一次主要反应。大量脾细胞如上所示染色。数据绘制为Env-tramer阳性和CD62L的平均百分比Lo（低），CD8+细胞与接种后天数的比较。误差条表示标准偏差（SD）。
图3。
图3。
针对Env p18-I10表位的特异性CTL的功能测定。（A） 接种5×10疫苗后7天6VSV-Env的PFU(n个=2），在针对p18-I10肽脉冲或中脉冲对照P815靶细胞的标准铬释放试验中使用大块脾细胞。针对环境诱变剂阳性CD8的百分比，对效应器与目标物的比率进行了标准化+细胞。显示了一个具有代表性的分析。误差条表示分析的标准偏差。（B） 接种5×10疫苗后7天6VSV环境(n个=2），用p18-I10肽在布雷费尔丁A存在下刺激大体积脾细胞5小时，并用抗CD8抗体和同型对照、抗IFN-γ或抗TNF-α抗体染色，并用流式细胞术进行分析。右上角的门和相应数字表示细胞因子或同型控制阳性CD8的百分比+细胞。显示了两种小鼠的结果。
图4。
图4。
VSV-Gag疫苗接种后对Gag主要反应的MHC I类四聚体和细胞内细胞因子定量。（A） 接种5×10疫苗后5天6VSV-Gag的PFU(n个=4）或VSV-rwt(n个=3），从接种BALB/c小鼠中分离出大量脾细胞，并用Gag四聚体、抗CD8和抗CD62L抗体进行染色。收集流式细胞术数据，仅CD8+分析中包括淋巴细胞。左上象限显示CD8的百分比+Gag四聚体阳性细胞和CD62LLo（低）（B）如上所述接种小鼠，并在接种后5至11天每隔2天检查一次主要反应。大量脾细胞如上所示染色。数据绘制为四聚体阳性CD62L的平均百分比Lo（低），CD8+细胞与接种疫苗后的天数。误差条表示标准偏差（SD）。（C） 接种5×10疫苗后7天6VSV-Gag的PFU(n个=2），用Gag免疫优势肽在brefeldin A存在下刺激大体积脾细胞5 h，用抗CD8抗体和同型对照、抗IFN-γ或抗TNF-α抗体染色，并用流式细胞术进行分析。右上角的门和相应数字表示细胞因子或同型对照阳性CD8细胞的百分比。显示了一只具有代表性的小鼠的结果。
图5：。
图5：。
VSV-GagEnv疫苗接种后对Gag和Env主要反应的定量和时间进程。接种5×10疫苗后，在指示点收集BALB/c小鼠的大量脾细胞6VSV GagEnv的PFU(n个=4/时间点）或VSV rwt(n个=3/时间点）。除抗CD8和抗CD62L抗体外，还用Gag（A）和Env（B）四聚体对脾细胞进行染色。数据绘制为四聚体阳性CD62L的平均百分比Lo（低），CD8+细胞与接种后天数的比较。误差条表示标准偏差（SD）。
图6。
图6。
VSV-GagEnv疫苗接种后Gag和Env特异性CTL的细胞内细胞因子染色。接种5×10疫苗后7天6VSV-Env的PFU(n个=2），用Gag免疫优势肽（A）或p18-I10肽（B）在布雷费尔丁A存在下刺激大体积脾细胞5小时。然后用抗CD8抗体和同型对照、抗IFN-γ或抗TNF-α抗体对细胞进行染色，并用流式细胞术进行分析。右上角的门和相应数字表示细胞因子或同型对照阳性CD8细胞的百分比。显示了一只具有代表性的小鼠的结果。
图7。
图7。
比较rVSV或rVV对Gag和Env的主要反应。小鼠腹腔注射5×106VSV-Env的PFU(n个=3）或5×106vPE16的PFU(n个=2），rVV表达HIV-1 Env（A），或与5×106VSV-Gag的PFU(n个=3）或5×106vVK1的PFU(n个=2），表达HIV-1 Gag-pol（B）的rVV。在接种疫苗后的指定天数分离出大量脾细胞，并用Env（A）或Gag（B）四聚体以及抗CD8和抗CD62L抗体进行染色。从每个值中减去背景四聚体染色（<0.6%）。误差条表示标准偏差（SD）。
图8。
图8。
静脉和静脉接种与VSV-Env的比较。小鼠经静脉接种106VSV-Env的PFU，体积为10至20μl(n个=4）或腹腔注射5×106VSV环境的PFU(n个= 3). 接种疫苗7天后，分离出大量脾细胞，并用Env四聚体进行染色。流式细胞术数据仅包括CD8+细胞。图中显示了两个具有代表性的图。文中报告了所有小鼠的平均值。
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