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.2002年2月15日；21(4):483-92.
doi:10.1093/emboj/21.4.483。

Aurora-A过度表达揭示了四倍体化是p53-/-细胞中心体扩增的主要途径

帕特里克·梅拉尔迪 1, 本田精工, 埃里希·A·尼格
附属机构

Aurora-A过度表达揭示了四倍体化是p53-/-细胞中心体扩增的主要途径

帕特里克·梅拉尔迪等人。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

长期以来，中心体数量的畸变与非整倍体和肿瘤发生有关，但其起源尚不清楚。在这里，我们研究了Aurora-A激酶的过度表达如何导致培养细胞中心体扩增。我们发现过量的Aurora-A不会解除对中心体复制的调控，而是通过细胞分裂缺陷和随后的四倍体产生额外的中心体。其他有丝分裂激酶（Polo-like kinase 1和Aurora-B）的过度表达也会导致多核化和中心体数量的增加。p53检测点的缺失加剧了这种表型，为典型的p53-/-细胞中心体扩增提供了一个可信的解释。我们认为，细胞分裂过程中的错误，再加上检测不到由此产生的超倍性，是肿瘤中心体数量畸变的主要原因。

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数字

无
图1。Aurora-A的中心体扩增不需要激酶活性。(A类)EGFP–Aurora-A的定位模拟内源性蛋白质的分布。用EGFP–Aurora-A wt（绿色）转染HeLa细胞24小时，并用抗γ-微管蛋白抗体染色中心体（红色）和DAPI染色DNA（蓝色）。(B类)EGFP–Aurora-A是一种活性激酶。使用抗GFP抗体从转染的U2OS细胞中免疫沉淀Wt和KD突变体EGFP–Aurora-A。体外在[γ]存在的情况下进行激酶分析-32P] ATP和髓鞘碱性蛋白（MBP）作为外源性底物（左侧面板），用抗GFP抗体免疫印迹法（右侧面板）证实恢复相同。（C和D）中心体扩增不需要Aurora-A活性。用指示的构建体转染CHO细胞40小时，并在羟基脲（HU）存在或不存在下培养。(C类)用GFP荧光检测转染细胞，用抗γ-微管蛋白抗体观察中心体。细胞被计数为中心体数目正常（一个或两个可见的γ-微管蛋白点）或中心体数量过多（>2个γ-微管蛋白点）。(D类)直方图显示了三个独立实验的结果（每个实验400-600个细胞），条形图表示标准偏差。比例尺：10µm。
无
图2。极光A在S期不会引起中心体扩增。用wt或KD突变型EGFP–Aurora-A转染HeLa细胞48小时，并在有或无羟基脲（HU）的情况下培养。通过荧光显微镜鉴定转染细胞(A类)以及使用Aurora-A的GFP荧光定量的中心体数量（或抗C-Nap1染色；未显示）(B类). 直方图显示了三个独立实验的结果（每个实验400-600个细胞），条形图表示标准偏差。比例尺：10µm。
无
图3。Aurora-A过度表达导致多核化，同时中心体扩增。(A类)用wt或KD突变体EGFP–Aurora-A转染HeLa细胞48 h，并用免疫荧光显微镜进行分析。转染细胞用GFP荧光（绿色）鉴定，中心体用抗C-Nap1抗体（红色）染色，DNA用DAPI（蓝色）染色。比例尺：10µm。(B类)转染细胞根据其中心体数量是否正常（一个或两个荧光点）或是否有两个以上的中心体，以及它们是单核还是多核进行分类。直方图显示了三个独立实验的结果（每个实验400-600个细胞），条形图表示标准偏差。
无
图4。Aurora-A过度表达细胞的细胞分裂失败(A类)用wt或KD突变体EGFP–Aurora A转染HeLa细胞，并用免疫荧光显微镜进行分析。转染细胞用GFP荧光（绿色）鉴定，DNA用DAPI（蓝色）染色。箭头表示滞后染色体和相互连接的DNA桥。比例尺：10µm。(B类)图示Aurora-A过度表达对晚期有丝分裂/胞质分裂细胞比例（深灰色条）和多核细胞频率（浅灰色条）的影响的直方图。在指定的时间点对转基因细胞进行分类。三个独立实验（每个实验300–600个细胞）的平均结果，条形图表示标准偏差。
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图5。Aurora-A过度表达细胞的四倍体化。用wt EGFP–Aurora-A转染HeLa细胞，用碘化丙啶染色，并通过定量免疫荧光显微镜测量其DNA含量。细胞被分类为具有2N（G1)，2-4N（S），4N（G）2)5或6N，或7或8N DNA含量。直方图显示三个独立实验的结果（每个实验300–600个细胞），条形图表示标准偏差。
无
图6。Plk1、Aurora-B或细胞松弛素D诱导的多核化与中心体扩增相关。用所示的构建物转染HeLa细胞48小时，或用细胞松弛素D（0.6µg/ml）处理30小时。(A类)转染细胞通过GFP荧光或抗HA抗体染色（绿色）进行鉴定，中心体通过抗C-Nap1抗体（红色）进行可视化。比例尺：10µm。(B类)细胞根据中心体数量是否正常（一个或两个荧光点）或两个以上，以及是单核还是多核进行分类。柱状图显示了三个独立实验的结果（每个实验400–600个细胞），条形图表示标准偏差。
无
图7。p53缺失有利于中心体额外拷贝的产生。Wt MEF或p53–/–用wt EGFP–Aurora-A、EGFP-Plk1或EGFP？Aurora-B转染MEF 48 h，并进行免疫荧光显微镜检查。(A类)转染细胞用GFP荧光（绿色）鉴定，中心体用抗C-Nap1抗体（红色）染色，DNA用DAPI（蓝色）染色。比例尺：10µm。(B类)中心体数量按照图1图例中的描述进行计数。柱状图显示了三个独立实验的结果（每个实验400–600个细胞），条形图表示标准偏差。
无
图8。细胞分裂缺陷是导致数值中心体畸变和非整倍体的主要途径。根据这个模型，四倍体化（而不是增强中心体复制）是中心体数量畸变的普遍原因。具体地说，我们认为一些明显的初级细胞周期错误导致有丝分裂退出失败，从而产生具有4N DNA和两个中心体的四倍体细胞。在p53中+/+背景，这样的牢房将在G区被捕1和/或消除。这很可能是DNA损伤检查点激活的结果，尽管目前不能排除监测中心体状态的机制。然而，在缺乏功能性p53检查点的情况下，这些细胞将进行额外一轮DNA复制和中心体复制，从而产生具有四个中心体的多倍体后代。在随后的有丝分裂中，这些细胞经常会形成多极纺锤体，从而导致染色体不稳定和非整倍体。
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