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.2002年2月；22(3):849-55.
doi:10.1128/MCB.22.3849-855.2002。

醛脱氢酶3a1缺乏小鼠角膜结构正常

大卫·W·尼斯 1, 埃里克·F·沃鲁塞克, 小杰拉尔德·罗宾逊, 乔兰·皮亚提戈斯基
附属公司

醛脱氢酶3a1缺乏小鼠角膜结构正常

大卫·W·奈斯等。 分子细胞生物学. 2002年2月.

摘要

我们构建了一只ALDH3a1缺失小鼠，以研究这种酶的作用，该酶包含小鼠角膜上皮中近一半的总水溶性蛋白。ALDH3a1缺陷小鼠存活且可繁殖，角膜上皮的水溶性蛋白质含量约为野生型小鼠的一半，酶谱和免疫印迹测定不含ALDH3a1。尽管ALDH3a1（-/-）小鼠角膜的蛋白质含量和ALDH3a活性有所下降，但通过组织学分析和电子显微镜检查时，其与野生型角膜没有明显区别，并且通过光镜和裂隙灯显微镜检查，其透明。没有证据表明存在补偿性蛋白质或酶。尽管ALDH3a1在小鼠角膜中的功能尚不清楚，但我们的数据表明，至少在实验室条件下，其酶活性对于角膜的透明性和维持是不必要的。

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数字

图1。
图1。
ALDH3a1缺陷小鼠的产生。（A） 小鼠ALDH3a1基因位点由灰色线表示，外显子由黑盒上方的数字标识。显示了用于克隆、Southern blot分析和在多连接体处线性化载体的限制性图谱。双箭头描绘了来自Afl公司II Southern blot分析的摘要；阴影框表示用作探针的区域。这个上海II位在括号中，表示它仅存在于pBS-SK（−）的聚合剂中。虚线后面的小箭头描绘了PCR分析中的扩增区域，预测大小如下箭头所示。新霉素盒上有标签，箭头指示其转录方向。标记为S的方框表示包含翻译终止密码子和假定转录终止子的序列（见正文）。（B） ALDH3a1等位基因野生型（+/+）、杂合子（+/-）和纯合子（−/−）动物的Southern blot分析。对于野生型和纯合子通道，加载1μg DNA，对于杂合子通道则加载2μg DNA。（C） 杂合子之间交配后代中野生型和敲除ALDH3a1等位基因的PCR分析区域。（D） 小鼠野生型（+/+）、杂合子（+/-）和敲除型（−/−）ALDH3a1等位基因的PCR分析结果。（E） 206个ALDH3a1杂合子交配后代的ALDH3a基因型分布。
图2。
图2。
ALDH3a1表达。（A） 来自ALDH3a1野生型（+/+）、杂合子（+/-）和敲除（−/-）小鼠角膜上皮的10μg水溶性蛋白的SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺）。标记的大小和位置显示在左侧。主要的68-kDa带是转酮醇酶（38），主要的51-kDa带是ALDH3a1。（B） 用抗ALDH3抗体进行免疫印迹检测。SDS-PAGE与面板A相同，但每条通道中装载1μg蛋白质。（C） 使用苯甲醛和NADP测定ALDH3a1活性的酶谱+作为基底。SDS-PAGE按A组进行。
图3。
图3。
角膜上皮细胞中水溶性蛋白质含量。（A） 水溶性蛋白标准化为ALDH3a1基因敲除（−/−）和野生型（+/+）小鼠角膜上皮细胞的DNA含量。（B） 角膜上皮水溶性蛋白与来自ALDH3a1基因敲除（−/−）和野生型（+/+）小鼠的洗涤剂可溶性蛋白标准化。
图4。
图4。
免疫印迹分析检测ALDH1的补偿作用。（A） 对于SDS-PAGE，将来自野生型（+/+）和敲除型（−/-）角膜上皮的10μg水溶性蛋白加载到每条泳道上；SDS-PAGE后，用SyproRuby对印迹进行染色，以显示蛋白质。（B） 用抗ALDH1抗体进行免疫印迹检测。
图5：。
图5：。
一只42天龄ALDH3a1基因敲除小鼠（KO）和一只129/Sv野生型小鼠（WT）角膜的苏木精-伊红染色横截面显示正常组织分层。显微照片显示两个角膜中完整的上皮层、基质层和内皮层。
图6。
图6。
一只51天龄ALDH3a1基因敲除小鼠角膜横切后的透射电镜显示其结构正常。（A） 表面上皮主要由无核鳞状上皮（se）组成，但偶尔显示有核细胞（nu）；（B） 小鼠基底上皮（be）的基底部和相邻的前间质（st），具有正常结构，包括基底层（箭头）和相邻的半桥粒（箭头），但没有鲍曼膜；（C） 中央基质中的正常角膜细胞（kr）；（D） 正常外观的后基质（st）。Descemet膜（dm）和内皮（en）。杂合子和纯合子野生型小鼠的角膜结构类似正常。放大倍数，×15000。所有显微照片的校准棒，1.0μm。
图7。
图7。
图中显示了野生型（WT）和ALDH3a1敲除型（KO）眼睛。解剖后立即对眼睛进行成像。在双眼角膜下面可以看到棕色虹膜。每个透镜都可以通过瞳孔观察到。
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