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.2001年11月12日；155(4):557-70.
doi:10.1083/jcb.200107045。 Epub 2001年11月12日。

高尔基体结构和功能的维护取决于ER出口的完整性

T H病房 1, R S Polishchuk公司, S卡普兰, K Hirschberg公司, J利平科特·施瓦茨
附属公司

高尔基体结构和功能的维护取决于ER出口的完整性

T H病房等。 J细胞生物学. .

摘要

高尔基体由一系列巨大的组件组成，这些组件在细胞内形成独特的结构和功能。在这里，我们使用定量荧光成像技术和超微结构分析来确定高尔基体是稳定的还是稳定的细胞器。我们发现所有类别的高尔基体成分都与该细胞器动态关联，这与稳定细胞器模型的预测相反。酶和再循环成分通过进出内质网的膜运输途径不断地离开和重新进入高尔基体，而高尔基基质蛋白和共变异构体在膜和细胞质之间进行持续、快速的交换。当内质网向高尔基体的转运被抑制，而不破坏依赖COPII的内质网输出机制（通过brefeldin A处理或Arf1[T31N]表达）时，高尔基体结构被分解，没有留下残留的高尔基体膜。相反，所有高尔基体成分重新分布到内质网、细胞质或内质网出口部位，这些部位仍活跃于选择性膜结合和外周相关货物的补充。组成活性Sar1[H79G]突变体诱导了类似现象，其具有导致COPII相关膜聚集到相邻区域的额外作用。在表达Sar1[T39N]的细胞中，Sar1是一种组成性非活性形式，完全破坏内质网的出口位点，高尔基糖基化酶、基质和流动蛋白都重新分布到内质网。这些结果与高尔基体含有稳定成分的假设相矛盾，这些成分可以作为其生物发生的模板。相反，他们认为高尔基复合体是一个动态、稳态系统，其膜可以成核，并由Sar1-COPII和Arf1-原子系统的活性维持。

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数字

图1。
图1。
用GFP标记的不同类别高尔基体成分的定位和动力学。（A） GFP嵌合体的示意图。EGFP或其光谱变体EYFP和ECFP与GalT的跨膜结构域和细胞质尾部（从左到右）在框架内融合（Cole等人，1996b）；p58，ERGIC53的全长大鼠同源物（Lahtinen等人，1992；Hauri等人，2000）；全长GRASP65（Barr等人，1998年）；全长εCOP（Presley等人，1998年）。（B） 预漂白图像显示NRK细胞稳定表达每一个GFP嵌合体。高尔基复合体（轮廓区域）被光漂白，并监测该区域荧光的恢复。显示了漂白后典型时间点的图像。棒材，10μm。
图2。
图2。
通过微管断裂阻断内质网向高尔基体的转运，在光漂白分析中区分膜结合高尔基体成分和细胞体交换高尔基体组分。稳定表达p58–GFP、GRASP65–GFP和εCOP–GFP的NRK细胞在冰上培养15分钟以解聚微管。以1μg/ml的浓度添加诺卡唑，以防止在加热至37°C时发生微管聚合。高尔基复合体（轮廓区域）在细胞达到显微镜阶段（即在诺卡唑诱导高尔基体碎裂之前的阶段）后立即进行光漂白，并监测该区域荧光的恢复。显示了漂白后的代表性时间点的图像。棒材，10μm。
图3。
图3。
BFA治疗后高尔基成分的体内再分配。（A） 所有类别的GFP标记高尔基体蛋白在BFA治疗前后均显示出预期的定位模式。表达每种指定结构的细胞在显微镜台上成像（未经处理）。然后加入5μg/ml的BFA，并在加入后30分钟再次对相同的细胞进行成像（+BFA）。（B） 添加BFA（5μg/ml）后立即表达GRASP65–GFP的细胞的时间序列。GRASP65–GFP在失去高尔基球池之前（1分钟和2分钟；箭头）重新分布到周围点状突起。在这两种情况下，点状结构都不会从高尔基体区域中消失（参见视频1）。棒材：（A）10μm；（B） 5微米。视频可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb/200107045/DC1.
图4。
图4。
BFA残留物局限于ER出口位置。（A） 免疫电镜显示Sec13-YFP或p58-GFP在NRK稳定细胞系中的分布未经治疗或经BFA治疗。第13节–YFP标记与VTC密切相关的膜，而p58–GFP在簇和周围内质网膜上都发现。（B） BFA处理细胞的光学显微镜表征。用BFA处理Sec13-YFP、转染±p58-CFP和GRASP65-GFP稳定的NRK，然后直接观察或固定并染色内源性GM130。箭头显示共同定位的点，白色方框内的区域在插图中被放大。在未经处理的细胞中，内源性GM130仅定位于高尔基体（图S2）。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb/200107045/DC1.棒材：（A）130 nm；（B） 5微米。
图5。
图5。
破坏内质网的组成非活性Arf1或组成活性Sar1突变体-高尔基体贩运也会导致高尔基体成分迁移到内质网出口位置。稳定表达Sec13-YFP的NRK细胞要么单独转染Arf1[T31N]或Sar1[H79G]，然后固定并染色GM130，要么与GTPase突变体和p58-CFP或GalT-CFP共同转染，然后直接可视化。箭头表示点状共定位。棒材，5μm。
图6。
图6。
COPII涂层在细胞膜上和膜下积极循环，导致内质网高尔基体运输中断。（A） 用Sar1[H79G]转染稳定表达Sec13-YFP的NRK细胞。将其固定，然后用Sar1构建物上的HA表位进行免疫荧光或免疫电镜染色。（B） 活细胞中Sec13–YFP标记结构的光漂白。如图所示，细胞要么未经处理，要么经BFA处理，要么表达Sar1[H79G]。标记区域被光漂白，随后监测荧光恢复。箭头指向漂白前和恢复后标记为Sec13的punta。（C） 在指定的时间测定Sec13-YFP漂白区和未漂白池的平均荧光强度，并用这些值之间预漂白比率的百分比表示。（D） 描述Sar1的GTPase循环的模型，表明该循环在本研究中使用的突变体中被阻断的位置。棒材：（A，左）5μm；（A，右）130纳米；（B） 5微米。
图7。
图7。
高尔基体成分被积极招募到ER-高尔基体贩运中断的细胞中的内质网出口位置。使用稳定表达p58–GFP或GRASP65–GFP的NRK细胞，将未经处理的细胞在冰上培养15分钟以解聚微管。添加1μg/ml诺卡唑以防止高尔基体前体的运动，并立即对细胞进行成像。BFA处理的细胞与5μg/ml BFA孵育30分钟，然后在成像前以相同的方式制备。成像前16小时，用突变的Sar1构建物瞬时转染表达Sar1[H79G]的细胞。标记区域被光漂白，随后监测荧光恢复。箭头指向漂白前和恢复后的punta。棒材，5μm。
图8。
图8。
构成性非活性Sar1[T39N]突变导致内质网出口位点的破坏，并将所有高尔基体成分重新分布到内质网。（A） 用Sar1[T39N]转染稳定表达Sec13-YFP的NRK细胞。将其固定，然后用Sar1构建物上的HA表位进行免疫荧光或免疫电镜染色。（B） 稳定表达GalT–CFP的NRK细胞与Sar1[T39N]和p58–YFP或GRASP65–GFP联合转染。转染后16h，直接观察细胞或固定细胞，并染色内源性GM130。注意，在对照细胞中，即那些不表达Sar1[T39N]的细胞，内源性GM130和瞬时转染的GRASP65–GFP的染色仅限于高尔基体，没有ER背景（图S2）。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb/200107045/DC1.棒材：（A，左）5μm；（A，右）650 nm；（B） 5微米。
图9。
图9。
内质网到高尔基体运输的扰动：它们对内质网-高尔基体系统内蛋白质分布和形态的影响概述。（A） ER–高尔基体膜内COPII、COPI、GalT、p58和GRASP65的正常稳态分布。COPI、COPI和GRASP65在内质网出口域（如精心制作的出芽内质网轮廓所示）和高尔基体结构上的COPI和CRASP65的稳态丰度下，在膜上和膜外快速交换。可以从内质网转移并靶向高尔基体的转运中间产物的形成预计分两个不同阶段进行。第一阶段通过COPII的动态交换活性招募选定类别的蛋白质（例如p58和基质蛋白质）。此阶段可能会被Sar1[T39N]阻塞。第二阶段导致其他类别的蛋白质（例如，糖酵解酶和质膜定向货物）的募集，并依赖于Arf1-涂层系统的交换活性。第二阶段被BFA、Arf1[T31N]和Sar1[H79G]阻断。（B） BFA、Arf1[T31N]或Sar1[H79G]对第二阶段阻塞的影响。在这些条件下，Sar1–COPII系统仍然活跃，而Arf1–共聚体系统被破坏，COPI释放到细胞质中。GRASP65和p58与通过Sar1/COPII活动仍在运行的ER导出域动态关联。在缺乏Arf1–共构体系统的情况下，已经从先前存在的高尔基体结构中循环出来的糖基化酶以及为质膜目的而新合成的蛋白质无法被招募到这些位点。高尔基体结构随着时间的推移而解体，其成分重新分布回内质网，分泌运输停止。（C） 用Sar1[T39N]阻断I期的效果。在这些条件下，Sar1–COPII和Arf1–互变异构体系统均受到抑制。在缺乏所有内质网输出活动的情况下，正常进入分泌途径的分子在内质网内不会发生隔离和分类。COPII通过Sec13-GFP评估，与GRASP65（和其他基质蛋白）、p58和GalT一样，沿着内质网膜广泛定位。高尔基体结构解体，因为高尔基体成分在内质网中循环时无法维持其膜。
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中的注释

  • 让我们做高尔基。
    西澳大利亚州威尔斯。 西澳大利亚州威尔斯。 细胞生物学杂志。2001年11月12日；155(4):498-9. doi:10.1083/jcb.200110112。Epub 2001年11月12日。 细胞生物学杂志。2001 PMID：11706045 免费PMC文章。

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引用人

  • Rab1b通过靶向DGAT2的ER-脂滴促进脂滴生长。
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