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.2001年11月1日；15(21):2865-76.
doi:10.1101/gad.934301。

软骨缺氧：HIF-1α对软骨细胞生长停滞和存活至关重要

西班牙血吸虫 1, H E瑞恩, S迪德里克森, T小林, M骑士, R S约翰逊
附属公司

软骨缺氧：HIF-1α对软骨细胞生长停滞和存活至关重要

西班牙血吸虫等。 基因开发. .

摘要

血管供氧中断或缺乏是许多常见人类疾病的标志，包括癌症、心肌梗死和中风。哺乳动物组织缺氧反应的主要介质是转录因子低氧诱导因子1（HIF-1）及其氧敏感成分HIF-1α。围绕HIF-1α和缺氧反应的一个关键问题是，这种转录因子在从功能性血管床移出的细胞中的作用；在这方面有证据表明，它可以作为一种生存因子或诱导生长停滞和凋亡。为了更深入地研究HIF-1α在体内缺氧中的作用，我们使用组织特异性靶向来删除无血管组织中的HIF-1α：发育中的骨骼的软骨生长板。我们在这里首次证明哺乳动物的发育生长板是缺氧的，这种缺氧发生在其内部而不是其外围。由于这种发育性缺氧，生长板内部缺乏HIF-1α的细胞死亡。这与CDK抑制剂p57的表达减少以及HIF-1α缺失生长板中BrdU掺入水平增加有关，表明这些动物出现HIF-1β调节生长停滞缺陷。此外，我们发现生长板中VEGF的表达是通过HIF-1α依赖和非依赖机制调节的。特别是，我们提供证据表明，细胞死亡区域周围软骨细胞中VEGF的表达以HIF-1α依赖的方式上调，这反过来又诱导异位血管生成。总之，我们的研究结果对缺氧反应和HIF-1α在发育和组织细胞存活中的作用具有重要意义；它们还说明了体内HIF-1α反应的复杂性，并为生长板的发育机制提供了新的见解。

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数字

图1
图1
野生型生长板中缺氧和HIF-1α蛋白的检测。(a、 b条)野生型E15.5胫骨近端骨骺中EF-5的Brightfield和免疫荧光检测(c（c）)的覆盖一和b条. (d日)E15.5胫骨和周围肌肉组织中EF-5的免疫荧光检测。(e（电子）)免疫过氧化物酶法检测野生型E15.5胎儿胫骨近端骨骺HIF-1α蛋白；箭头表示阳性染色的细胞核；为了定向，绘制生长板的边界。
图2
图2
突变动物的产生缺乏HIF-1α生长板软骨细胞。(一)的示意图colIICre公司转基因。(b、 c（c）)E15.5胚胎的全量β-半乳糖苷酶染色。(d日)反义原位杂交分析Cre公司E15.5胚胎野生型后肢组织切片上的核糖探针。(e（电子）)新生儿野生型照片(左边)和空老鼠室友(正确的). (f–小时)全骨骼茜素红S染色；新生野生型(左边)和突变型(正确的)前肢(左边)和后肢(正确的)如所示（f）; 新生的野生型胸腔如图所示克; 新生儿无肋骨笼如图所示小时.
图3
图3
野生型和无效动物长骨生长板和气管的组织学分析。(a、 b条)野生型和突变型新生儿胫骨的H&E染色；股骨、腓骨和跟骨远端骨骺的部分也显示出来。(c、 d日)新生儿野生型和无效胫骨远端骨骺的H&E染色（一和b条分别）。(e–i)野生型和空气管的H&E染色。克和我是更高的功率（f）;小时是的更高幂e（电子）.
图4
图4
野生型和无动物的胸腔和肋间血管分析。(a、 b条)野生型和突变型新生儿胸骨和肋骨软骨胸骨接合处的H&E染色。(c、 d日)新生儿野生型和突变型肋骨的H&E染色（一和b条分别）。(e、 （f）)软骨胸骨交界处附近野生型和变异型肋骨笼的Brightfield照片；肋骨周围的肋间血管在野生型和突变型标本中都清晰可见。(g、 小时)软骨胸骨交界附近区域野生型和突变肋骨周围软骨膜中von Willebrand因子的免疫染色；箭头表示阳性染色的毛细血管。
图5
图5
大量细胞死亡和表达减少的证据第57页突变生长板软骨细胞中的mRNA。(一)原位杂交分析II型胶原蛋白分别来自新生野生型和突变型胫骨和肋骨笼的组织学切片上的cRNA；显示了野生型和突变型标本的近端骨骺和肋骨笼的暗场。(b条)原位杂交分析X型胶原蛋白E15.5野生型和无效胫骨及新生肋骨组织切片上的cRNA；显示了野生型和突变型标本的近端骨骺和肋骨笼的暗场。(c（c）)原位杂交分析第57页E18.5野生型和突变型胫骨组织切片上的cRNA；显示了野生型和突变型标本的暗场。(d日)野生型和突变型新生儿胫骨近端骨骺TUNEL阳性细胞的荧光检测；与野生型标本相比，突变体中有大量TUNEL阳性细胞。
图6
图6
损失的证据PGK公司突变生长板软骨细胞的表达和增殖率增加。(a、 b条)原位杂交分析PGK公司E15.5野生型和突变型胫骨和腓骨组织切片上的cRNA；显示了野生型和突变型标本的暗场。(c、 d日)分别在E15.5野生型和突变胫骨的组织学切片上检测BrdU阳性细胞。切片用甲基绿复染。(e（电子）)坏死区外BrdU阳性细胞的定量，定义为来自明显坏死区的多个细胞层；阳性百分比是所选区域中计数的细胞总数的函数。可见无接合软骨细胞掺入量显著增加。误差条代表一个标准误差；对每个基因型的五个独立胚胎的长骨中的10个生长板区域进行计数。（露天酒吧）野生型（WT）；（红色条）空。
图7
图7
HIF-1α依赖和独立调节VEGF表达、EF-5结合增加和突变生长板异位血管生成的证据。(a、 b条)原位杂交分析血管内皮生长因子野生型和突变型胫骨和腓骨组织切片E15.5上的cRNA；显示了野生型和突变型标本的暗场（暴露于光乳剂=14d）。(c、 d日)E15.5突变股骨组织切片VEGF-cRNA原位杂交分析；分别显示了亮场和暗场（暴露于光乳剂=24 d）。(e、 （f）)E18.5野生型和突变型胫骨近端骨骺中EF-5的免疫荧光检测。(g–j)突变新生儿胫骨近端骨骺组织切片的H&E染色；在异位血管生成区域周围画正方形和圆形；小时是放大倍数更高的图像克.
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