Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans

doi:10.1101/gad.927801

.2001年10月15日；15(20):2654-9.

doi:10.1101/gad.927801。

Dicer在秀丽隐杆线虫RNA干扰和小RNA合成中的作用

R F Ketting公司¹, S E Fischer公司, E伯恩斯坦, T Sijen公司, G J汉农, R H石膏

附属公司

PMID： 11641272
预防性维修识别码： PMC312808型
内政部： 10.1101/添加927801

Dicer在秀丽隐杆线虫RNA干扰和小RNA合成中的作用

R F Ketting公司等。基因开发. 2001.

.2001年10月15日；15(20):2654-9.

doi:10.1101/gad.927801。

作者

R F Ketting公司¹, S E Fischer公司, E伯恩斯坦, T Sijen公司, G J汉农, R H石膏

附属

¹荷兰乌得勒支乌普萨拉兰8号Hubrecht实验室和生物医学遗传学中心。

PMID： 11641272
预防性维修识别码： PMC312808型
内政部： 10.1101/添加927801

摘要

双标记RNA可以通过一个进化上保守的过程，即RNA干扰（RNAi）或转录后基因沉默（PTGS）来抑制同源基因的表达。沉默的一个机制是RNP复合体降解靶mRNA，其中包含大约22 nt的siRNA作为底物选择的指南。一种名为Dicer的双齿核酸酶被认为是siRNA产生的蛋白质。在这里，我们在体内和体外对Dicer（K12H4.8；dcr-1）的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans ortholog）进行了表征。dcr-1突变体在RNAi中显示缺陷。此外，表型异常和RNA分析的结合表明，dcr-1在由小时间RNA（let-7）及其靶标（例如lin-41）组成的调节途径中发挥作用。

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数字

图1
(一)双标记RNA（ds）和单链RNA（ss），均长500 bp，用*秀丽线虫*胚胎。siRNA由dsRNA以时间依赖的方式产生，而不是由ssRNA产生（时间点：0、30和60分钟）。(b条)抗DCR-1抗血清（I）的升高可以免疫沉淀siRNA-producing活性。免疫前血清（P）不活跃。左侧车道包含RNA标记。(*c（c）*)siRNA由*秀丽线虫*提取物（C）比*果蝇属*摘录（D）。在这两个反应中，均使用500-bp dsRNA作为底物。(d日)不同长度dsRNA的时间进程（0、30、60分钟），使用*秀丽线虫*摘录。siRNA是由35 bp及更长的dsRNA产生的，但较大的dsRNA分子显然是更好的底物（每个反应中添加的RNA数量和质量相等）。(*e（电子）*)siRNA的产生依赖于ATP。（车道1)底物（500 bp）未与提取物孵育；（车道2)与缺乏ATP的提取物发生反应；（车道三)将ATP添加回耗尽的提取物中；和（车道*4,5*)添加不可水解的ATP类似物（ATPγS和ADPNP）。(*（f）*)500-bp dsRNA与*秀丽线虫*胚胎提取物导致阶梯的形成，具有siRNA的间隔特征。（车道1)未处理RNA；（车道2)提取物处理后的相同RNA；（车道*3,4*)对车道的相同反应1和2，但具有100-bp dsRNA底物和400-bp单链尾。阶梯停止在RNA底物不再双链的位置。

图2
(一)旁边的野生动物*dcr-1型*纯合缺失动物。卵母细胞受精不发生，或偶尔发生。缺乏受精不是由精子缺陷引起的，因为与野生型雄性交配并不能挽救这种表型（数据未显示）。通过引入野生型的*dcr-1型*然而，受精卵不会孵化，母亲表现出卵子缺失表型（数据未显示）。(b条)卵母细胞异常。卵母细胞通常不在性腺分裂，但在*dcr-1（pk1531）*变异动物这是经常观察到的（箭头表示分裂面）。(*c（c）*——*e（电子）*)携带GFP转基因的动物在生殖系中表达。野生型动物(n个 = 25）性腺显示清晰的荧光(*c（c）*)被抗GFP的dsRNA沉默(d日) (n个 = 29). 动物纯合子*dcr-1型*删除显示之前的荧光(n个 = 18）以及RNAi之后(*e（电子）*) (n个 = 22），表明RNAi响应有缺陷。

图3
(一)野生型模式*jam-1:：gfp*成年动物缝细胞染色。缝细胞融合，无法识别单个细胞。(b条)在*dcr-1型*缺失突变体，成年动物的缝细胞未能融合，并经历了另一轮细胞分裂。(*c（c）*)呈现的动物包含高拷贝数*hsp:：dcr-1*转基因（见材料和方法）。由于缺乏卵母细胞，该动物是不育的，类似于*林-41*基因敲除表型。卵母细胞应该位于两个黑条之间的区域。(d日)Dicer转换*let-7*在体外将双链前体转化为21-nt RNA分子。无线电标签*let-7*前体RNA(*果蝇属*序列；Pasquinelli等人，2000年；显示在车道中5)被孵化*果蝇属*胚胎提取物（lane2)，骰子免疫前沉淀物（车道三)和掷骰子免疫沉淀（lane4). （车道1)与500-bp dsRNA的对照反应(*e（电子）*)一种Northern印迹，在其上探测野生型和突变动物的RNAlet-7; U6用于加载控制。（车道*1,2*)来自L4期野生型和*dcr-1（pk1351）*纯合子突变动物。已处理的*let-7*信号在*dcr-1型*突变群体，且时间越长*let-7*前体RNA积累。我们发现了类似的结果（处理后的*let-7*)当我们抑制*dcr-1型*通过RNAi，如车道所示三和4; 这两条通道中的RNA是从成年动物中分离出来的。

图4
Dicer可能参与两个不同的过程，这两个过程都需要将dsRNA加工成小RNA（stRNA，小时间或调节；或siRNA，短干扰）。其中一种途径（dsRNA诱导）通过RISC复合物和RNAi导致RNA降解。第二种途径（let-7依赖性）通过内源性小时间RNA与其mRNA靶标之间的相互作用导致翻译抑制。在stRNA分支中，双链前体以及stRNA和靶RNA之间的匹配并不完美（至少对于*let-7*和*线-4*). 我们通过在dsRNA分子中包含一个突起来表明这一点。这并不是为了指定不匹配区域的大小或数量。

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