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。2001年11月；21(21):7268-76.
doi:10.128/MCB.21.21.7268-7276.2001。

Bid是Bcl-2家族中广泛表达的促凋亡蛋白，具有脂质转移活性

M D Esposti先生 1, J T Erler公司, J A希克曼, C潜水
附属公司

Bid是Bcl-2家族中广泛表达的促凋亡蛋白，具有脂质转移活性

M D Esposti先生等。 摩尔细胞生物学。 2001年11月。

摘要

Bid是Bcl-2家族中一种丰富的促凋亡蛋白，对在肝脏等原发组织中诱导死亡受体介导的凋亡至关重要。有人提出Bid的作用是将其截短形式tBid重新定位到线粒体，以促进凋亡细胞色素c的释放。Bid定位到线粒体的机制尚不清楚。我们在这里报道了新的生物化学证据，表明Bid在线粒体和其他细胞内膜之间具有脂质转移活性，从而解释了其向线粒体的动态迁移。首先，生理浓度的磷脂，如磷脂酸和磷脂酰甘油，在与富含内质网的轻质膜孵育时，诱导线粒体中全长Bid的积累。其次，天然和重组Bid以及tBid在相同条件和相同纳米摩尔浓度下表现出脂质转移活性，导致线粒体重新定位和释放细胞色素c。因此，Bid可能参与线粒体磷脂的运输和再循环。我们讨论了Bid的这种新作用如何与其促凋亡作用相关。

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图1
图1
磷脂改变了Bid的线粒体分布。（A）在健康小鼠肝脏获得的三种亚细胞组分中检测到不同形式的Bid受体带。P10是通过以10000×克而P20是主要含有ER相关光膜的颗粒，通过在20000×克S20是后一次离心后残留在上清液中的细胞溶质提取物，显示出与S10组分相似的Bid免疫印迹模式。用C-20和R&D抗体的混合物对每个组分的完全相等的蛋白质浓度（24μg）进行免疫印迹，以检测所有形式的Bid.印迹细胞色素c（c）（底部）和细胞色素氧化酶亚基IV（未显示）用作线粒体标记。虚线箭头表示存在与Bid抗体反应的28-kDa带。（B） 外源磷脂不会单独影响纯化线粒体中的Bid分布（图1），但当相同的线粒体与富含ER的部分P20共存时，Bid分布会发生变化（图2）。线粒体和轻质膜最初通过22000×克解冻冷冻丸后，通过离心法将线粒体从P20组分中分离出来（参见材料和方法），并在9000×克纯化的线粒体重新悬浮在caspase分析缓冲液中（20 mM K-HEPES，0.25 M蔗糖，2 mM二硫苏糖醇，1 mM EDTA[pH 7.4]，补充0.1%[vol/vol]蛋白酶抑制剂）2 mg/ml，然后在30°C下孵育30分钟，每毫升含有0.2毫克磷脂（除心磷脂外，所有合成二醇类似物溶解在氯仿中），每毫升不含（第i组）或含有（第ii组）1毫克组分P20。对照组（−）样品含有等量的溶剂（小于最终体积的1%）。培养结束时，样品以10000×克在低温条件下，用R&D抗体进行Western印迹分析等体积的颗粒和上清液。这两块面板取自曝光略有不同的重复斑点。（C） 将完整的小鼠肝线粒体在分析缓冲液（20 mM K-HEPES、0.12 M甘露醇、0.08 M KCl、1 mM EDTA[pH7.4]，补充蛋白酶抑制剂）中稀释至1 mg/ml，并在30°C下用预成型脂质体培养30 min（0.1 mg/ml，在干燥不同磷脂的氯仿溶液后获得）。另外，将分别获得的每毫升0.9 mg P20组分添加到孵育混合物中，然后通过离心分离线粒体，如面板B图例所述。上清液（顶部）和颗粒（底部）的等量用C-20和面板A图例中所述的R&D抗体进行了探测。作为参考，通道1和通道2中分别含有不含脂质的线粒体和单独的P20。注意，外源性脂质，尤其是PG，增加了与线粒体颗粒相关的24-kDa Bid带的比例。
图2
图2
Bid显示脂质体的脂质转移活性。（A） 左侧面板中的方案说明了使用荧光脂质探针在供体和受体脂质体之间进行脂质转移分析的原理（参考文献和27）。箭头表示LTP的行动，这从根本上改变了整个过程的平衡动态。右侧面板通过实验说明了这些原理。含有100 nM BODIPY FL C5-HPA的供体脂质体显示出猝灭荧光，这是因为探针相对于膜中其他脂质的摩尔分数较高（见下文），但在用洗涤剂Triton X-100溶解和稀释探针后，荧光较高。（B） 在与OM渗透性和无细胞分析相同的条件下，用100 nM BODIPY FL C5-HPA的最终浓度测量脂质转移活性（见材料和方法）。供体脂质体是通过将含有1:3（wt/wt）脂质探针的乙醇溶液与纯化磷脂（44%PC、31%PI和25%PS）的混合物快速注射在分析缓冲液中制备的。通过乙醇注射含有（wt/wt）20%CL、35%PC、25%PI和18%PS的脂质混合物制备受体脂质体，并以3.5μg/ml的最终浓度（即超过供体脂质体浓度的15倍）添加。结果是通过记录485nm激发的时间分辨发射光谱获得的。虚线光谱表示供体脂质体单独的荧光发射，其随时间稳定。添加从小鼠肾脏分离的天然Bid（相当于最终浓度约10 nM-Bid）后，荧光迅速增加，并稳定在所示的中间光谱。随后加入受体脂质体后，随着时间的推移，荧光显著增加：培养15分钟后记录顶部光谱。右侧面板显示了515 nm处峰值发射的整个时间过程。
图3
图3
脂质转移与细胞色素释放的相关性c（c）（A）用BODIPY FL C5-HPA与磷脂（50%PC、25%PI和25%PS）的1:3（wt/wt）混合物和由LUV组成的受体脂质体制备的超声供体脂质体，以时间为单位测量脂质转移。这些LUV是通过过滤挤压（38）制备的，磷脂混合物与OM（8，25）的磷脂混合物极为相似，即50%PC、30%PE、12.5%PI、5%PG和2.5%CL。在检测之前，供体和LUV脂质体均通过Sigma PD10柱凝胶过滤纯化。在最终浓度为30 nM的分析缓冲液中平衡供体脂质体，然后在每毫升250 ng重组小鼠Bid（rBid）（即10 nM）的缺失（底部痕迹）或存在（顶部痕迹）的情况下，每毫升添加2μg LUV受体。连续监测515 nm处的荧光发射，并在490 nm处激发。（B） 如图A所示，使用每毫升2.5μg小鼠肝线粒体作为受体膜，测量来自超声供体脂质体的脂质转移。在添加线粒体（顶部迹线）之前，将30 nM重组小鼠Bid（rBid）与供体脂质体混合，可加快自发转移率（底部迹线）（C）将小鼠肝线粒体与10 nM重组Bid在分析缓冲液中孵育15分钟。除对照样品（−）外，线粒体还与0.1 mg/ml由不同带负电荷磷脂形成的脂质体孵育，然后通过离心分离，如图1C所示。对等量上清液进行细胞色素免疫印迹c（c）如常规无细胞分析（22）。
图4
图4
重组Bid显示的类LTP活性的特异性。（A）供体和受体脂质体首先在图2B所示的实验条件下混合10分钟以上，以在自发脂质转移中达到平衡。然后按照指示添加总共1 nM（25 ng/ml）的重组人Bid，并在约10分钟内记录荧光变化。在没有其他添加的情况下获得顶部痕量，而在存在25μg/ml强烈抑制脂质转移的BSA时获得底部痕量（5，33）。随后，每毫升添加50μg冻融猪心线粒体（相当于每毫升约20μg膜脂），以进一步刺激脂质转移。脂质探针的最终浓度为50 nM。（B） 在与面板A所示类似的实验中，在添加猪心线粒体后1 h测量PA模拟探针的荧光增加。随后，将反应混合物以10000×克分离线粒体15分钟，将颗粒重新悬浮在含有0.5%（vol/vol）Triton X-100的分析缓冲液中，然后在试管中稀释。按照图2图例所述，测量颗粒中回收的荧光。仅用线粒体获得底部光谱（不使用脂质探针），用受体和供体脂质体加Bid获得中间光谱，用供体和受体脂质体加Bid和线粒体获得顶部光谱（开放符号）与供体脂质体孵育，如图2B所示，每毫升添加3.5μg受体脂质体后，通过时间分辨光谱监测脂质转移。显示了发射最大值（515 nm；F515）中强度的时间过程。自发转移到受体脂质体的过程与在Bak存在下测量的过程基本相同，为了清晰起见，未显示。用猪心线粒体作为受体也得到了类似的结果（未显示）。（D） 将Caspase 8-裂解Bid（tBid）及其重组小鼠Bid的母体全长制剂添加到供体脂质体（如图3所示通过超声处理获得）中，并将其稀释至最终浓度为30 nM BODIPY FL C5-HPA。大约3分钟后，每毫升添加2.5μg LUV受体脂质体，并记录脂质转移的初始速率，如图3A所示。tBid和全长Bid在高达200 nM的蛋白质浓度范围内的脂质转移率也存在类似差异（未显示）。a.u.，任意单位。
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