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.2001年9月25日；98(20):11587-91.
doi:10.1073/pnas.201279298。 Epub 2001年9月11日。

人载脂蛋白E4“结构域相互作用”导入小鼠载脂蛋白E

R L拉菲 1, L M Dong先生, 小R V Farese, K H Weisgraber公司
附属公司

人载脂蛋白E4“结构域相互作用”导入小鼠载脂蛋白E

R L拉菲等。 美国国家科学院程序. .

摘要

人类载脂蛋白E4（apoE4）优先与低密度脂蛋白（包括极低密度脂蛋白质）结合，并与动脉粥样硬化和神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病）风险增加相关。这种结合偏好是Arg-112存在的结果，这导致氨基末端结构域中的Arg-61与羧基末端结构域中的Glu-255相互作用。含有Cys-112的载脂蛋白E2和载脂蛋白E3优先与高密度脂蛋白（HDL）结合，不显示载脂蛋白4结构域相互作用。与apoE4一样，鼠标apoE包含等效的Arg-112和Glu-255，但缺少关键的Arg-61等效物（它包含Thr-61）。因此，小鼠apoE不显示apoE4结构域的相互作用，因此，其行为与人类apoE3相似，包括与HDL的优先结合。为了评估apoE4domain相互作用在动脉粥样硬化和神经退行性变中的潜在作用，我们试图将apoE4-结构域相互作用引入小鼠apoE。用精氨酸替代小鼠载脂蛋白E中的Thr-61，在体外将高密度脂蛋白与极低密度脂蛋白的结合偏好转化为高密度脂蛋白质，这表明载脂蛋白E4结构域的相互作用可以在体内引入小鼠载脂素E。利用胚胎干细胞中的基因靶向性，我们创造了表达Arg-61 apoE的小鼠。杂合子Arg-61/野生型apoE小鼠表现出人类apoE4/E3杂合子中发现的两种表型：优先结合低密度脂蛋白和血浆中Arg-61 apoE丰度降低，反映出其更快速的分解代谢。这些发现证明了apoE4结构域相互作用在小鼠体内成功引入apoE。Arg-61载脂蛋白E小鼠模型可以确定载脂蛋白E4结构域相互作用在脂蛋白代谢、动脉粥样硬化和神经变性中的作用。

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数字

图1
图1
Arg-61的生成和表征阿波等位基因。(A类)序列重组、基因定位战略。一个7-kb生态RI公司-BstB公司1个碎片插入包含外显子1、2、3和5′侧翼序列a的上游新磁带两侧液氧磷地点。包含外显子4和3′的1.3kb片段侧翼序列通过PCR扩增并克隆到抗坏血酸下游1个站点新磁带。基因靶向载体与阿波ES细胞中的基因座在第61密码子的第二个位置位于外显子3′端并引入独一无二的数据元素我限制网站。A类新磁带两侧液氧磷现场已关闭接近内含子3中新的Arg-61密码子以监测正确的整合点突变。靶向ES细胞克隆和小鼠通过基因组DNA消化鉴定生态RI公司和Southern印迹阿波外显子4探针，其中发现了一个10.3kb的扩增片段，而重量为8.3kb的片段。C介导切除新盒式磁带产生突变体阿波等位基因（指定为Arg-61阿波).
图2
图2
人类apoE和小鼠apoE的血浆脂蛋白结合偏好。对重组小鼠apoE和人类apoE亚型进行放射标记，与人血浆孵育，分馏成各种脂蛋白按大小分类-不包括FPLC。
图3
图3
不同组织器官载脂蛋白E mRNA水平的比较（+）小鼠和Arg-61靶向小鼠与Cre-deleter小鼠（R）杂交。(A类)从各种组织和器官中分离出总RNA来自wt和Agr-61小鼠，并使用Apoe公司外显子4探针。组织和器官包括：B、，脑；李，肝脏；卢，肺；M、 肌肉；四、小肠；T、 睾丸；H、 心脏；St，胃；K、 肾脏；Sk，皮肤；Sp，脾脏；和E，眼睛。(B类)显示了对照小鼠β-肌动蛋白杂交。
图4
图4
小鼠血浆和脑脊液载脂蛋白E的IEF和Western blot。小鼠apoE同种型用IEF和Western blot检测血浆和脑脊液。小鼠在出血前禁食4小时。
图5
图5
原代肝细胞分泌apoE的IEF和Western blot培养基。从wt和Arg-61/wt杂合小鼠，置于培养基中培养2天，以及收集培养基。培养基中的小鼠wt和Arg-61 apoE分别为通过IEF和Western blot检测进行评估。
图6
图6
杂合子血浆中wt和Arg-61载脂蛋白E的分布，高胆固醇饮食的基因靶向小鼠。Arg-61/wt载脂蛋白E杂合小鼠喂食Paigen饮食6天以增加VLDL水平。通过尺寸排除FPLC对未经处理的血浆进行分级。(上部)对应于不同的分数脂蛋白分类由IEF决定，载脂蛋白E由蛋白质印迹。
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