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。2001年9月3日；20(17):5008-21.
doi:10.1093/emboj/20.17.5008。

Hrs向早期内体招募网格蛋白

C莱博格 1, K G巴切, A Mehlum公司, E斯坦格, H斯坦马克
附属公司

Hrs向早期内体招募网格蛋白

C莱博格等。 欧洲工商管理硕士J。 。

摘要

肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物Hrs与细胞内转运和信号转导有关。Hrs含有磷脂酰肌醇3-磷酸结合FYVE结构域，有助于其内体靶向。在这里，我们发现Hrs和EEA1，一种参与内吞膜融合的FYVE结构域蛋白，定位于早期内体的不同区域。我们证明了Hrs与网格蛋白共定位，并且Hrs的C末端包含一个功能性网格蛋白盒基序，该基序与网格蛋白重链的末端β-螺旋桨结构域直接相互作用。在转染Hrs的细胞中观察到大量的网格蛋白向早期内体募集，但在缺乏C末端的Hrs细胞中没有观察到。此外，磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂沃特曼（wortmannin）导致Hrs和网格蛋白从内体中分离。虽然Hrs的过度表达并不影响转铁蛋白的内吞和再循环，但内吞的表皮生长因子和葡聚糖保留在早期内体中。这些结果为氯氰菊酯在早期内体上的募集提供了分子机制，并提示Hrs在从早期内体向晚期内体的贩运中的作用。

PubMed免责声明

数字

无
图1。Hrs、EEA1和氯氰菊酯在Rab5中的定位第79季度-BHK细胞过度表达。用Rab5转染BHK细胞Q79升固定前用0.05%的皂苷进行渗透。然后用抗EEA1染色(A类和C类)，反小时(B类和E类)或抗甲氰菊酯(D类和F类)并用共焦免疫荧光显微镜进行了研究。箭头表示共同本地化的示例。棒材，5µm。
无
图2。黑素瘤细胞中Hrs、EEA1和网格蛋白的定位。固定前用0.05%皂苷渗透的黑色素瘤细胞用抗EEA1染色(A类)，反小时(B类)和抗甲氰菊酯(C类). 箭头表示EEA1、Hrs和甲氰菊酯之间的共定位。黄色表示Hrs和甲氰菊酯之间的共同定位(D类). 箭头指向放大后的内体（G–I）。棒材，5µm。(E类和F类)（A–D）中箭头所示的内体放大图。箭头指向放大后的内体（G–I）。(G公司——我)三染色放大内体的合并图像。注意EEA1在蓝色和红色中的差异定位，以及氯氰菊酯在绿色和Hrs中的共定位（黄色）。
无
图3。Hrs的C末端结合网格蛋白TD(A类)结合氯氰菊酯（ter-Haar）的蛋白质序列比对等., 2000; 特奥等., 2001; 杨等., 2001). 这说明在Hrs的770-775残基中存在潜在的网格蛋白结合基序。Hrs是唯一在C末端具有网格蛋白盒基序的蛋白质。（B–E）Hrs与甲氰菊酯的相互作用(B类和C类)用pLexA中的诱饵构建物和pGAD中的猎物构建物转化L40报告酵母细胞。报告者β-半乳糖苷酶活性（以任意单位表示）表示结合，并表示为两个重复进行的独立实验的平均值。误差条表示±SEM。在（B）中，展示了一个三重链的网格蛋白，并指出了末端结构域（TD）、远端结构域（DD）和中心结构域（HD）。(D类)重组GST（泳道1），GST–小时707–775（车道2）或GST–小时707–770（通道3）固定在谷胱甘肽-Sepharose珠上，并与猪脑细胞液孵育。通过离心回收珠子并清洗。球团部分通过SDS-PAGE分解并转移至硝化纤维素。在用抗网格蛋白重链抗体检测网格蛋白之前，用Ponceau S（下面板）对印迹进行染色（上面板）。(E类)重组GST（车道1），GST–小时707–775（车道2）或GST–小时707–770（通道3），固定在谷胱甘肽-Sepharose微球上，并与纯化的重组网格蛋白末端结构域（TD）孵育1–579). 通过离心回收珠子并清洗。球团部分通过SDS-PAGE分解并转移至硝化纤维素。检测氯氰菊酯TD之前，用Ponceau S（下面板）对印迹进行染色1–579带有抗氯氰菊酯重链（上面板）。通道4表示重组氯氰菊酯TD的总量1–579添加到珠子中。
无
图3。Hrs的C末端结合网格蛋白TD(A类)在结合网格蛋白的蛋白质中发现的序列比对（ter Haar等2000年；特奥等., 2001; 杨等., 2001). 这说明在Hrs的770-775残基中存在潜在的网格蛋白结合基序。Hrs是唯一在C末端具有网格蛋白盒基序的蛋白质。（B–E）Hrs与甲氰菊酯的相互作用(B类和C类)用pLexA中的诱饵构建物和pGAD中的猎物构建物转化L40报告酵母细胞。报告者β-半乳糖苷酶活性（以任意单位表示）表示结合，并表示为两个重复进行的独立实验的平均值。误差条表示±SEM。在（B）中，展示了一个三重链的网格蛋白，并指出了末端结构域（TD）、远端结构域（DD）和中心结构域（HD）。(D类)重组GST（车道1），GST–小时707–775（车道2）或GST–小时707–770（通道3）固定在谷胱甘肽-Sepharose珠上，并与猪脑细胞液孵育。通过离心回收珠子并清洗。球团部分通过SDS-PAGE分解并转移至硝化纤维素。在用抗网格蛋白重链抗体检测网格蛋白之前，用Ponceau S（下面板）对印迹进行染色（上面板）。(E类)重组GST（车道1），GST–小时707–775（车道2）或GST–小时707–770（通道3），固定在谷胱甘肽-Sepharose微球上，并与纯化的重组网格蛋白末端结构域（TD）孵育1–579). 通过离心回收珠子并清洗。球团部分通过SDS-PAGE分解并转移至硝化纤维素。检测氯氰菊酯TD之前，用Ponceau S（下面板）对印迹进行染色1–579带有抗氯氰菊酯重链（上面板）。通道4表示重组氯氰菊酯TD的总量1–579添加到珠子中。
无
图3。Hrs的C末端结合网格蛋白TD(A类)结合氯氰菊酯（ter-Haar）的蛋白质序列比对等., 2000; 特奥等., 2001; 杨等2001年）。这说明在Hrs的770–775残基中存在潜在的网格蛋白结合基序。Hrs是唯一一种在C末端具有网格蛋白盒基序的蛋白质。（B–E）Hrs与甲氰菊酯的相互作用(B类和C类)用pLexA中的诱饵构建物和pGAD中的猎物构建物转化L40报告酵母细胞。报告者β-半乳糖苷酶活性（以任意单位表示）表示结合，并表示为两个重复进行的独立实验的平均值。误差条表示±SEM。在（B）中，展示了一个三重链的网格蛋白，并指出了末端结构域（TD）、远端结构域（DD）和中心结构域（HD）。(D类)重组GST（车道1），GST–小时707–775（车道2）或GST–小时707–770（通道3）固定在谷胱甘肽-Sepharose珠上，并与猪脑细胞液孵育。通过离心回收珠子并清洗。颗粒级分通过SDS–PAGE进行解析，并转移到硝化纤维素中。在用抗网格蛋白重链抗体检测网格蛋白之前，用Ponceau S（下面板）对印迹进行染色（上面板）。(E类)重组GST（车道1），GST–小时707–775（车道2）或GST–小时707–770（通道3），固定在谷胱甘肽-Sepharose微球上，并与纯化的重组网格蛋白末端结构域（TD）孵育1–579). 通过离心回收珠子并清洗。球团部分通过SDS-PAGE分解并转移至硝化纤维素。检测氯氰菊酯TD之前，用Ponceau S（下面板）对印迹进行染色1–579带有抗氯氰菊酯重链（上面板）。通道4表示重组氯氰菊酯TD的总量1–579添加到珠子中。
无
图4。(A类——C类)过度表达的Hrs将网格蛋白引入早期内体。用myc标记的Hrs（A和B）或Hrs转染BHK细胞1–706（C）并在固定前用0.05%的皂苷进行渗透。用抗myc（左面板）、抗EEA1（A，中面板）或抗氯氰菊酯（B和C，中面板。(D类——F类)过度表达的小时数不会招募AP1、AP2或AP3。在固定之前，用myc标记的Hrs转染BHK细胞或HEp-2细胞（对于AP3），并用0.05%的皂苷进行渗透。细胞分别用抗myc（左面板）、抗AP1（D，中面板）、反AP2（E，中间面板）或抗AP3（F，中间面板。右侧面板显示合并后的图像，黄色表示共同定位。棒，5µm。
无
图4。(A类——C类)过度表达的Hrs将网格蛋白引入早期内体。用myc标记的Hrs（A和B）或Hrs转染BHK细胞1–706（C）并在固定前用0.05%的皂苷进行渗透。用抗myc（左面板）、抗EEA1（A，中面板）或抗氯氰菊酯（B和C，中面板。(D类——F类)过度表达的小时数不会招募AP1、AP2或AP3。在固定之前，用myc标记的Hrs转染BHK细胞或HEp-2细胞（对于AP3），并用0.05%的皂苷进行渗透。细胞分别用抗myc（左面板）、抗AP1（D，中面板）、反AP2（E，中间面板）或抗AP3（F，中间面板。右侧面板显示合并后的图像，黄色表示共同定位。棒材，5µm。
无
图5。过度表达的Hrs将dynamin和Eps15引入内体。用myc标记的Hrs转染BHK细胞(A类和B类)或小时1–706 (C类)固定前用0.05%的皂苷进行渗透。用抗myc（左面板）、抗dynamin（A，中面板）或抗Eps15（B和C，中面板。右侧面板显示合并的图像，黄色表示共同定位。棒材，5µm。
无
图6。Hrs过表达内体的电子显微镜。(A类)来自未转染BHK细胞的早期内体在固定前已内吞5 nm BSA–金（箭头）10分钟。(B类)Hrs在myc-Hrs转染的BHK细胞中的定位，该细胞在固定前已内吞5nm BSA-gold（箭头）1h。解冻后的冰冻切片用抗myc抗体标记，然后用兔抗鼠抗体和15nm蛋白A-金标记。注意Hrs-阳性隔间的涂层外观和聚集。(C类)甲氰菊酯在myc-Hrs转染细胞中的免疫电镜定位。解冻后的冰冻切片用兔抗甲氰菊酯LC（10 nm金）进行双重标记，然后用小鼠抗myc抗体和兔抗鼠抗体（15 nm金）标记。标记显示，氯氰菊酯定位于特征性myc-Hrs诱导的内胚层。（C，插图）一个涂有甲氰菊酯的凹坑，标记有山羊抗甲氰菊酯，然后是兔抗羊蛋白和15纳米蛋白A–金。(D类)Eps15在myc-Hrs转染细胞中的免疫电镜定位。解冻的冷冻切片用抗Eps15（10 nm蛋白A–金）双重标记，然后标记myc表位（15 nm蛋白A–金）。在特征性Hrs阳性的内体外壳上有强烈的Eps15标记。(E类)myc-Hrs转染细胞中动态蛋白的免疫电镜定位。将内吞5 nm BSA–金1 h的细胞（箭头）解冻冷冻切片，用小鼠抗动力蛋白1抗体（Hudy 1）标记，然后用兔抗鼠抗体和15 nm蛋白A–金（箭头）标记。在因Hrs过度表达而表现出包衣内体特征性聚集的细胞中，dynamin的标记定位于内胚层以及质膜上典型的网格蛋白包衣凹坑（CP，插图）。条形，200 nm。
无
图7。过度表达的Hrs不干扰转铁蛋白的内吞或再循环，但抑制EGF降解。(A类)心率对转铁蛋白内吞的影响。将转铁蛋白受体单独转染BHK细胞（对照组）或转铁蛋白接收器与Hrs联合转染6 h。将细胞与Ru标记的转铁蛋白在37°C下孵育15分钟，并用蛋白酶去除表面结合的转铁酶。使用ORIGEN分析仪测量细胞相关转铁蛋白的量，并以总细胞相关转铁蛋白的百分比表示内吞转铁蛋白。误差条代表重复进行的三个独立实验的SEM。(B类)Hrs对转铁蛋白回收的影响。将转铁蛋白受体单独转染BHK细胞（对照组）或转铁蛋白接收器与Hrs联合转染6 h。将细胞与Ru标记的转铁蛋白在37°C下孵育30分钟，并通过MESNA去除部分微孔中的表面结合转铁蛋白。将MESNA处理的细胞进一步培养至指定的时间。使用ORIGEN分析仪测量细胞相关转铁蛋白的量，细胞内转铁蛋白以总细胞相关转铁蛋白的百分比表示。误差条表示两个独立实验的扫描电镜，两个实验重复进行。(C类)Hrs对EGF降解的影响。用myc标记的Hrs转染HEp-2细胞6小时，并在37°C下内化罗丹明-EGF 1小时。将细胞清洗并进一步培养3小时。固定前用0.05%的皂苷使细胞渗透。用抗myc染色并用共焦免疫荧光显微镜进行研究。对每个时间点的10个转染细胞和10个非转染细胞的罗丹明-EGF信号的平均强度进行量化，并以未分级EGF的百分比表示，与追踪前的罗丹胺-EGF的信号相比。误差线表示±SEM。
无
图8。过度表达的Hrs抑制EGF从早期到晚期内体的转运。用myc标记的Hrs转染HEp-2细胞6小时，并在37°C下与罗丹明-EGF孵育1小时(A类——F类). 清洗部分细胞并进一步培养3小时(G公司——L（左）). 固定前用0.05%的皂苷使细胞渗透。用抗myc（A和G）或抗EEA1抗体（C和I）染色，并用共焦免疫荧光显微镜进行研究。绿松石表示Hrs和EEA1（E和K）之间的共同定位。紫色表示EGF和EEA1（F和L）之间的共同定位。黄色表示Hrs和EGF（D和J）之间的共同定位。棒材，5µm。
无
图9。在Hrs过表达的细胞中，内吞右旋糖酐从早期到晚期的内体运输受到抑制。用myc标记的Hrs转染HEp-2细胞6小时，并在37°C下与生物素-右旋糖酐孵育1小时(A类). 清洗细胞并进一步培养3小时(B类). (C类)37°C下用生物素-右旋糖酐孵育1小时的未转染细胞。(D类)追踪3小时后为未转染细胞。用抗myc（左面板A和B）、抗Hrs（左面板C和D）或链霉亲和素–Cy3（中面板）对细胞进行染色，并用共焦荧光显微镜进行研究。右侧面板显示合并的图像，黄色表示共同定位。棒材，5µm。
无
图10。Wortmannin破坏Hrs和网格蛋白与转铁蛋白阳性内体的结合。HEp-2细胞与Alexa孵育488–转铁蛋白在37°C的温度下放置30分钟(A类)或存在(B类)100 nM沃特曼。固定前用0.05%的皂苷使细胞渗透，以去除细胞溶质蛋白。用抗-Hrs（左面板）和抗氯氰菊酯（中面板）对其进行染色，并用共焦荧光显微镜进行研究。箭头表示Hrs、网格蛋白和内化转铁蛋白之间的共同定位。箭头指向用抗网格蛋白染色的假定TGN区域。Bar，5µm。
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