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.2001年9月；21(17):5899-912.
doi:10.1128/MCB.21.17.5899-5912.2001。

生长因子可以通过影响葡萄糖代谢影响细胞生长和存活

M G范德海登 1, D R Plas公司, J C Rathmell公司, C J福克斯, M H哈里斯, C B汤普森
附属公司

生长因子可以通过影响葡萄糖代谢影响细胞生长和存活

M G范德海登等。 分子细胞生物学. 2001年9月.

摘要

多细胞生物的细胞依赖于外源信号进行生存、生长和增殖。使用白细胞介素-3（IL-3）依赖性细胞系检测这三个过程之间的关系。IL-3的固定剂量不能确定细胞凋亡的阈值。相反，生长因子浓度的增加导致细胞周期G（1）期的逐渐缩短和更快速的增殖扩张。生长因子浓度增加也导致糖酵解速率成比例增加。矛盾的是，生长在高浓度生长因子中的细胞在提取生长因子后对细胞死亡的敏感性增加。这种敏感性与提取生长因子后糖酵解速率的变化幅度相关。为了研究糖酵解产物可用性的变化是否影响线粒体启动的凋亡，我们通过调节培养基中的葡萄糖水平来人为限制糖酵分解。与生长因子撤除一样，葡萄糖限制导致Bax移位，线粒体膜电位降低，细胞色素c重新分布到胞浆。相反，通过过度表达谷氨酸1增加细胞自主葡萄糖摄取显著延迟了生长因子退出后的细胞凋亡。这些数据表明，生长因子的主要功能是调节葡萄糖摄取和代谢，从而维持线粒体内环境稳定，并启用细胞生长所需的合成代谢途径。与这一假设一致，发现与葡萄糖摄取和糖酵解承诺有关的三个基因的表达，即谷氨酸1、己糖激酶2和磷酸果糖激酶1的基因，在生长因子退出后迅速下降到几乎无法检测到的水平。

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图1
图1
细胞增殖对生长因子的可用性作出反应。（A） 细胞在含有指定量IL-3的培养基中培养。在逐渐适应IL-3的规定水平至少1周后，将细胞以同等密度放置；在指定的时间测量培养物中的细胞数量。图中显示了随时间变化的平均细胞数（和平均值的一个标准误差[SEM]）。（B） 按照面板A所述培养的细胞被切换到含有0.35 ng IL-3/ml的培养基中培养1天，并在指定的时间测定细胞数量。显示了随时间变化的平均细胞数（和SEM）。（C） 用不同量的IL-3培养细胞，如A组所述，但添加caspase抑制剂zVAD-fmk。显示了所示时间的平均细胞数（和SEM）。（D） 表达Bcl-x水平增加的细胞L（左）如面板A所述，在不同量的IL-3中培养。显示了指定时间的平均细胞数（和SEM）。
图2
图2
随着生长因子的限制，细胞生长和细胞周期进程减少。（A） 使用Coulter Z2颗粒分析仪测量在含有指示量IL-3的培养基中培养的细胞体积。显示了平均细胞体积（和平均值的标准误差[SEM]）。（B） 通过碘化丙啶染色和流式细胞术测定在含有指示量IL-3的培养基中生长的细胞的细胞周期特征。显示了细胞周期每个阶段的细胞数。（C） 在有BrdU存在的情况下培养含有指定量IL-3的细胞。在指定的时间固定细胞，并通过流式细胞术测定免疫染色样品中包含BrdU的细胞百分比。BrdU阳性率（BrdU+)显示培养物中随时间变化的细胞。（D） 在含有不同量IL-3的培养基中培养的细胞被切换到含有0.35 ng IL-3/ml的培养基。显示了培养1天后随着IL-3浓度增加的平均细胞体积（和SEM）。
图3
图3
糖酵解的速率与存在的生长因子的量和细胞大小相关。（A） 通过测量5-三H-葡萄糖三高-高2O.显示了平均糖酵解速率（以及平均值的标准误差）。（B） 显示了多个独立测定的糖酵解速率和细胞体积。细胞大小与糖酵解速率呈正相关(P（P）< 0.01).
图4
图4
使用大量生长因子培养的细胞在退出生长因子后更容易发生细胞死亡。（A） 从生长因子中提取含有指定量IL-3的培养细胞，并使用流式细胞术通过碘化丙啶排除法测定细胞活力。显示了随时间推移提取生长因子后的平均存活率（和平均值的标准误差[SEM]）。（B） 在补充了指定数量的IL-3（从：中提取）的培养基中生长的细胞被清洗，并直接切换到含有指定数量IL-3（到：）的培养液中（−IL-3表示没有IL-3）。显示生长因子限制48小时后的平均细胞存活率（和SEM）。
图5
图5
生长因子退出后，线粒体的底物可用性受到限制。（A） 测量在有（+IL-3）或无（−IL-3）IL-3的情况下培养12 h的细胞的耗氧量，并在（+FCCP）添加原核细胞FCCP前后测量耗氧量。FCCP破坏线粒体内膜上的质子梯度，使氧气消耗仅受底物可用性的限制。显示了上述每个条件下的平均耗氧率（以及平均值的标准误差[SEM]）。dPO公司2/dt，氧张力的变化除以时间的变化。（B） 在缺乏IL-3的情况下培养12 h的细胞被分为线粒体（M）和细胞溶质（S）组分。对级分进行细胞色素探测c（c）或细胞色素氧化酶IV作为细胞分馏的对照。（C） 在添加FCCP前后，使用完整的细胞进行NADH荧光测量。绘制了添加FCCP前后平均稳态荧光值（和SEM）之间的差异。
图6
图6
糖酵解速率的变化幅度与细胞死亡率相关。将适于在含有指定量IL-3的培养基中生长的细胞在有（+IL-3）或无（−IL-3）IL-3的情况下培养12小时。显示了每个条件下的平均糖酵解速率（和平均值的标准误差）。还显示了IL-3退出后糖酵解（Δ）的变化。
图7
图7
外源性生长因子受体维持细胞活力的能力与其维持糖酵解的能力相关。（A） 从IL-3中提取转染EpoR（闭合方块）、PDGF-R（闭合菱形）或无（对照）（开放方块）的FL5.12细胞，并将其置于含有Epo（−IL-3/+Epo）、PDGF（–IL-3/+PDGF）或无外源性生长因子（−IL-3）的培养基中。显示了每种条件随时间的平均细胞活力（以及平均值[SEM]的标准误差）。（B） 将转染有EpoR、PDGF-R或无EpoR（对照）的细胞在有IL-3存在的情况下培养，或从IL-3中提取，并置于含有Epo（−IL-3/+Epo）、PDGF（−IL-3/+PDGF）或无外源性生长因子（−IL-3）的培养基中培养12小时。显示了每个细胞群中测得的平均糖酵解速率（和SEM）。
图8
图8
生长因子较多的细胞在营养限制后更容易死亡。（A） 用0.35 ng IL-3/ml和11 mM葡萄糖清洗等量的细胞，并将其重新悬浮在含有不同量葡萄糖的缓冲液中。测定并显示了指示葡萄糖浓度下的平均糖酵解速率（和平均值的标准误差[SEM]）。（B） 在含有相同量IL-3但仅含有0.05 mM葡萄糖的培养基中清洗并重新悬浮适于培养具有指定浓度IL-3的细胞。通过碘化丙啶排除法和流式细胞术在停糖后的指定时间测定细胞活力。显示了每个条件下随时间变化的平均细胞存活率（和SEM）。
图9
图9
葡萄糖限制后的细胞死亡模拟了生长因子撤除引起的细胞死亡。（A） 控制（Neo）和Bcl-xL（左）-用0.35 ng IL-3/ml培养的表达细胞被洗涤并重新悬浮在含有相同量IL-3但只有0.02 mM葡萄糖的培养基中。显示了葡萄糖限制后随时间变化的平均细胞存活率（和平均值的标准误差[SEM]）。（B） 使用电位染料TMRE评估线粒体电位，细胞在存在或不存在IL-3（上图）或高浓度或低浓度葡萄糖（分别为10或0.02mM）（下图）下生长6小时。请注意，两个面板中的10 mM葡萄糖加IL-3条件使用了相同的直方图。（C） 在存在（+IL-3）或不存在（−IL-3）IL-3或0.02 mM葡萄糖的情况下生长15 h的细胞线粒体部分中检测到Bax构象。制备线粒体裂解物，使用构象特异性抗Bax抗体进行免疫沉淀（IP），并对Bax进行免疫印迹（IB）。（D） 控制（Neo）和Bcl-xL（左）-表达细胞在亚细胞分馏前用0.35 ng IL-3/ml在11 mM葡萄糖（对照）或0.02 mM葡萄糖存在下培养18 h。细胞色素的数量c（c）通过Western blotting测定线粒体（M）和细胞溶质（S）组分中的（Cyt.c）和细胞色素氧化酶亚基IV（Cox IV）。Cox IV是一种位于线粒体内膜的整合膜蛋白，作为对照，证明胞质部分中不存在线粒体。
图10
图10
退出IL-3后，谷氨酸1的表达可提高生存能力。（A） 用对照载体或谷氨酸1表达载体转染细胞。转染细胞经渗透处理后，用谷氨酰胺特异性抗体进行两步反应染色，并用流式细胞仪进行分析。不含初级抗体（Ab）的染色细胞作为对照。这些数据代表了三个独立克隆的结果。（B） 将转染对照载体（Neo）或谷氨酸1表达载体的细胞从IL-3中取出1天，并用流式细胞仪通过碘化丙啶染色测定细胞存活率。误差条显示了三份样品的标准偏差。（C） 从控制载体（Neo）和Bcl-x制备RNAL（左）-在指定时间从IL-3中提取表达细胞。Northern印迹与肌动蛋白、微管蛋白、谷氨酸1、己糖激酶2（Hk-2）和PFK-1（PFK-1）的特异性探针串联杂交。
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