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.2001年9月；21(17):5742-52.
doi:10.1128/MCB.21.17.5742-5752.2001。

AMP活化蛋白激酶的酵母同源物Snf1p和细胞周期蛋白依赖性激酶Pho85p对自噬和糖原积累的拮抗控制

Z Wang（Z王） 1, W A威尔逊, M A富士野, P J罗奇
附属公司

Snf1p、AMP活化蛋白激酶的酵母同源物和细胞周期素依赖性激酶Pho85p对自噬和糖原积累的拮抗控制

Z Wang（Z王）等。 分子细胞生物学. 2001年9月.

摘要

在酿酒酵母中，当细胞被剥夺营养时，糖原作为碳水化合物储备积累。SNF1是一种编码葡萄糖去抑制所需蛋白激酶的基因，SNF1中突变的酵母减少了糖原积累并伴随糖原合成酶失活。snf1菌株的合成恢复只会导致短暂的糖原积累，这意味着存在其他依赖于snf1的糖原储存控制。基因筛查显示，参与自噬的两个基因APG1和APG13可能受SNF1调控。在进入固定相的野生型细胞中观察到自噬活性增加，但在snf1菌株中这种诱导作用受到损害。自噬缺陷突变体在接近固定相时能够合成糖原，但无法维持其糖原储存，因为随后的合成受到损害，磷酸化酶Gph1p的降解增强。因此，GPH1的缺失部分逆转了自噬突变体中糖原积累的损失。液泡葡萄糖苷酶SGA1的缺失也保护了糖原的储存，但只是在固定相的很晚时候。因此，Gph1p和Sga1p可降解物理上不同的糖原库。Pho85p是一种细胞周期素依赖性蛋白激酶，可拮抗SNF1对糖原合成的控制。与野生型细胞中的水平相比，进入固定期的pho85突变体中自噬的诱导被夸大，但在apg1 pho85突变体中被阻断。我们认为Snf1p和Pho85p分别是自噬的正调节器和负调节器，可能通过Apg1和/或Apg13。snf1细胞中糖原储存不足可归因于进入稳定期时的合成缺陷和缺乏自噬导致的糖原水平维持受损。

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数字

图1
图1
糖原积累snf1 pcl8 pcl10具有多拷贝抑制质粒的细胞。菌株为EG328-1A（野生型[WT]）或ZWS2(snf1 pcl8 pcl10). 质粒为插入了指定基因的pRS425（载体）或pYEP13。在屏幕中，APG1公司被发现17次，亚太13国集团被发现1次，PDE2型被发现8次，RCK2号机组被发现3次，GAC1公司被发现2次，并且YGR161C型被发现2次。细胞在30°C的SD-Leu平板上生长2天，然后暴露于碘蒸气中2分钟以评估糖原积累，染色越深，糖原积累越大。
图2
图2
糖原积累apg1型细胞在合成完全培养基中长期培养。野生型（EG328-1A）和apg1型（ZWP1-5）细胞在液体SD培养基中生长。在指定的时间，通过计数细胞数量来测量细胞浓度（□，野生型细胞；○,apg1型单元格）。取等分试样测定糖原含量（■，野生型细胞；●,apg1型单元格），如材料和方法中所述。显示了三个独立实验之一的代表性数据。
图3
图3
损失全球生产总值1逆转糖原消耗apg1型细胞。细胞在液体SD培养基中生长，并在指定时间取等分试样，以测定材料和方法中所述的糖原含量。使用了以下菌株：EG328-1A（野生型[■]）、ZWP1-2(apg1型[●]）ZW49-161(apg1 gph1[▴]）和ZW45-7(加仑每小时1[⧫]). 显示了三个独立实验之一的代表性数据。
图4
图4
两者都有全球生产总值1和新加坡通用航空公司影响糖原降解。细胞在液体SD培养基中生长，并在指定时间取等分样品进行糖原测量。使用了以下菌株：EG328-1A（野生型[■]）、ZW41-6(sga1号机组[▾]），ZW48-3(apg1 sga1[●]）和ZW48-3(gph1 sga1[⧫]）。显示了三个独立实验之一的代表性数据。
图5
图5
各种自噬基因破坏了细胞内糖原的积累。细胞在液体SD培养基中生长，并在指定时间取等分试样，以测定材料和方法中所述的糖原含量。使用了以下菌株：EG328-1A（野生型[■]）、ZWP1-5(apg1型)和ZW74-2(apg7号机组)（○），ZW75-3(自动驾驶2[▾]），ZW76-2(prb1型[▴]）和ZW77-4(pra1型[⧫]). 其他突变细胞的糖原积累动力学与prb1型细胞。
图6
图6
糖原积累apg17号机组和cvt9型细胞。细胞在液体SD培养基中生长，并在指定时间取等分试样，以测定材料和方法中所述的糖原含量。使用了以下菌株：EG328-1A（野生型[■]）、ZW83-1(apg17号机组[●]）和ZW84-4(cvt9型[⧫]). 显示了来自三个独立实验之一的代表性数据。
图7
图7
进入稳定期后诱导自噬。野生型（TN125）和apg7号机组（ZW105-3）细胞在液体SD培养基中生长。在指定的时间采集细胞。糖原含量（■，野生型菌株TN125●，apg7号机组)碱性磷酸酶活性（□，野生型菌株TN125；○,apg7号机组)按照方法和材料中的描述进行测量。显示了三个独立实验之一的代表性数据。
图8
图8
的影响SNF1系列和电话85关于自噬。野生型（TN125），snf1（ZW101-3），照片85（ZW102-1），以及apg7号机组（ZW105-3）细胞在YPD中生长到对数期，然后转移到SD（−N）。继续培养4小时。然后采集细胞，并按照材料和方法中的描述测量碱性磷酸酶活性。显示了三个独立实验之一的代表性数据。
图9
图9
的影响SNF1系列和电话85进入稳定期后的自噬。（A） 野生型（TN125）和snf1（ZW101-3）细胞在液体SD培养基中生长。在指定的时间采集细胞。碱性磷酸酶活性（■，野生型菌株TN125●，snf1)，按照材料和方法进行测量。显示了三个独立实验之一的代表性数据。（B） 野生型（TN125），照片85（ZW102-1），以及pho85 apg1（ZW115-1）细胞在液体SD培养基中生长。在指定的时间采集细胞。碱性磷酸酶活性（■，野生型菌株；⧫，第85页; □,pho85 apg1)按照材料和方法进行测量。显示了三个独立实验之一的代表性数据。
图10
图10
糖原积累snf1、snf1 pc18 pcl10、和snf1 pcl8 pcl10 gph1细胞。细胞在YPD中培养过夜，然后稀释1/200到合成完全培养基中。在指定的时间采集样品，并按照材料和方法中的说明测量糖原含量。使用以下菌株：EG353-1C(snf1[■]），ZWS2(snf1 pcl8 pcl10[●]）和ZW34-263(snf1 pcl8 pcl10 gph1[⧫]). 显示了三个独立实验之一的代表性数据。
图11
图11
糖原代谢和自噬之间的可能关系。描述了糖原的合成和可能的命运，实心箭头表示代谢相互转化，开放箭头表示物理易位，虚线表示调控联系。糖原是通过调节糖原合成酶（Gsy1,2p）和其他生物合成酶在对数后期合成的。在培养物饱和时，糖原的利用伴随着磷酸化酶（Gph1p）的激活，随后是一个合成和降解同时发生的再积累阶段。在同一时期，饥饿信号也会导致自噬增加，这至少对糖原水平有两种影响。首先，它通过细胞成分的再循环产生小分子，如氨基酸，这些小分子可以作为能量来源和/或合成中间体返回细胞液。通过一种未知的机制，自噬对糖原合成起着积极的控制作用。第二个潜在后果是糖原在Gph1p无法到达的液泡中被隔离，在固定相很晚的时候被液泡葡萄糖苷酶（Sga1p）降解。在没有自噬的情况下，这两个过程都不起作用。在早期到中期的稳定阶段，糖原被磷酸化酶降解，不再储存在液泡中，这两种情况都会导致总糖原水平的维持降低。
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