Apoptotic cleavage of cytoplasmic dynein intermediate chain and p150(Glued) stops dynein-dependent membrane motility

doi:10.1083/jcb.153.7.1415

.2001年6月25日；153(7):1415-26.

doi:10.1083/jcb.153.71415。

细胞质动力蛋白中间链和p150（Glued）的凋亡断裂阻止了动力蛋白依赖的膜运动

J D巷¹, M A Vergnolle女士, P G伍德曼, V J艾伦

附属公司

PMID： 11425872
预防性维修识别码： PMC2150727型
内政部： 10.1083/jcb.153.71415

细胞质动力蛋白中间链和p150（Glued）的凋亡断裂阻止了动力蛋白依赖的膜运动

J D巷等。 J细胞生物学. 2001.

.2001年6月25日；153(7):1415-26.

doi:10.1083/jcb.153.71415。

作者

J D巷¹, M A Vergnolle女士, P G伍德曼, V J艾伦

附属

¹英国曼彻斯特M13 9PT曼彻斯特大学生物科学学院。

PMID： 11425872
预防性维修识别码： PMC2150727型
内政部： 10.1083/jcb.153.71415

摘要

细胞质动力蛋白是动物细胞中主要的负向终末微管马达，与它的许多货物和动力蛋白复合体结合。细胞质动力蛋白和动力蛋白之间的相互作用是由细胞质动力蛋白中间链（CD-IC）与动力蛋白亚基p150（Glued）的结合介导的。我们发现，在培养哺乳动物细胞和爪蟾卵提取物的凋亡过程中，CD-IC和p150（Glued）都被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解。爪蟾CD-IC在靠近其NH（2）末端p150（胶接）结合域的保守天冬氨酸残基处快速裂解，导致膜上原本完整的细胞质动力蛋白复合物丢失。凋亡爪蟾卵提取物中CD-IC和p150（胶）的裂解导致细胞质动力蛋白驱动的内质网运动停止。凋亡细胞膜的运动性是通过从对照细胞液或从补充纯化细胞质动力蛋白-动力蛋白的凋亡细胞液中招募完整的细胞质动力素和动力蛋白来恢复的，这表明细胞质动力肽和动力蛋白与其膜载物之间的动态联系。

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数字

图1
CD-IC和p150^胶水在细胞凋亡过程中被裂解。（A）细胞溶胶由未经处理的人类HL60细胞（C）、用茴香霉素（A；5μg/ml）处理4h的细胞以及用茴香菌素和细胞渗透性capase抑制剂zVAD处理的细胞制成。FMK（Z）。用银染法（左）和免疫印迹法分析等量蛋白质。全长β-COP和p50的位置如所示（<）。（B）用5μg/ml茴香霉素或50μM足叶乙甙处理HL60细胞。使用所示抗体对在指定时间制备的细胞提取物进行免疫印迹。在zVAD存在下，使用每种试剂处理样品的最长时间。FMK也显示（Z）。（C） A类爪蟾鸡蛋提取物与10μM细胞色素孵育*c（c）*±半胱天冬酶抑制剂Ac-DEVD-CHO的指定时间。然后通过免疫印迹分析提取物。在所有小组中，使用的抗CD-IC抗体为70.1。

图2
CD-IC在NH内进行裂解₂-端子p150^胶水结合区域。（A）细胞质动力蛋白和动力蛋白的示意图，显示NH之间的相互作用₂CD-IC和p150的末端*^胶水*（B）CD-IC的表示，显示与细胞质动力蛋白和动力蛋白复合物的其他成分相互作用的区域。（C） a的免疫印迹爪蟾用细胞色素处理指定时间（小时）的鸡蛋提取物*c（c）*±Ac-DEVD-CHO，使用CD-IC的单克隆（70.1）和多克隆抗体。还显示了分子量标记的位置。

图3
的氨基酸序列*非洲爪蟾*与NH对齐的（Xl）CD-IC₂大鼠（Rn）CD-IC1、2A、2B和2C的末端。重点介绍了几种潜在半胱天冬酶裂解基序的位置。在每一种情况下，关键的天冬氨酸残基位于位置P₁（P₄P（P）_三P（P）₂P（P）₁)第页，共页爪蟾通过定点突变改变CD-IC。强调了用于生产多克隆抗体的肽序列。

图4
劈开爪蟾体外CD-IC发生在DSGD⁹⁹在另一个不明地点。（A）免疫沉淀的[³⁵S] 蛋氨酸标记的野生型或突变型（DSGA⁹⁹)CD-IC在凋亡细胞中孵育爪蟾在有或无Ac-DEVD-CHO或caspase 3和7抑制剂Casputin™的情况下，按照所示时间进行卵细胞溶质。两种解理产物，C₁和C₂，显示。注意C的外观₁被Casputin™阻止，并且不会使用CD-IC（DSGA）发生⁹⁹). （B–D）免疫沉淀[³⁵S] 甲硫氨酸标记的野生型或突变型（DSGA⁹⁹)将CD-IC与重组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶2（B）、3（C）和7（D）在30°C下培养2 h。通过评估体外翻译的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶2的裂解来确认半胱氨酸蛋白酶2的活性，同时使用体外翻译的PARP测试半胱氨酸水解酶3和7。（E）本地爪蟾将卵细胞质动力蛋白–动力蛋白与重组caspase 2（50 nM）或caspase 3（20 nM），±Ac-DEVD-CHO在37°C下孵育3 h。SDS-PAGE后通过免疫印迹分析蛋白质（CD-IC用多克隆抗血清检测）。

图6
在细胞凋亡过程中，细胞质动力蛋白复合物从细胞膜中释放出来爪蟾鸡蛋提取物。细胞溶胶（Cyt）和细胞膜（Mem）分别由对照提取物或凋亡提取物（C和A）制备。将等量的蛋白质加载到SDS-PAGE凝胶上，对总蛋白（A）进行银染，并使用所示抗体进行免疫印迹（B）。

图5
凋亡提取物中细胞质动力蛋白和动力蛋白复合物的去向。（A）从对照组或凋亡组中分离出微管马达爪蟾通过微管亲和性分离卵胞浆，然后在蔗糖密度梯度上分离，并进行银染和免疫印迹分析（CD-IC用70.1检测）。在凋亡梯度的第1部分中未发现CD-HC：该区域的银染是人工的。（B）使用抗CD-LIC抗体从对照（C）和凋亡（A）卵细胞溶胶中免疫沉淀细胞质动力蛋白复合物，并使用多克隆抗CD-IC肽抗体进行免疫印迹，以检测裂解（<<）和完整（<）CD-IC。（C）使用抗NH的单克隆抗体1618，通过三轮耗尽含有未分离CD-IC的细胞质动力蛋白复合物的对照（C；通道1）和凋亡（A；通道2）卵细胞溶胶₂-CD-IC的终点（仅显示了第1轮和第3轮的珠子；第3-6车道）。然后用抗CD-LIC微球（通道9和10）对耗尽的细胞溶胶（通道7和8）进行进一步免疫沉淀。所有组分用银染法检测DHC（顶部），并用抗CD-IC肽抗体进行免疫印迹，以检测裂解（<<）和未裂解（<）CD-IC（底部）。

图7
凋亡膜和非凋亡膜的运动特性。（A）通过从对照和凋亡中浮选制备膜爪蟾鸡蛋提取物，然后在各自的细胞液中孵育45分钟。然后使用三向连接指数对其进行运动性分析（见材料和方法）。（B）如图所示，将对照或凋亡细胞溶胶和细胞膜混合，并如上所示进行运动性分析。数值为三个独立实验的平均值±SEM。在每种情况下，在进行运动试验之前，将Ac-DEVD-CHO添加到2μM的最终浓度。每个分析还显示了具有代表性的VE-DIC场（27μm宽）。

图9
添加纯化的猪脑细胞质动力蛋白-动力蛋白可恢复内质网的形成。（A）通过从凋亡卵提取物中浮选制备膜，并在存在或不存在猪脑细胞质动力蛋白-动力蛋白（CD）的凋亡细胞液中培养45分钟。为了避免增加的运动成分发生凋亡裂解，运动试验中包括2μM Ac-DEVD-CHO。数值为三个独立实验的平均值±SEM。（B）使用所示抗体（C，控制胞浆和胞膜；a，凋亡胞浆和细胞膜）对猪脑动力蛋白-动力蛋白补充实验的总样本进行免疫印迹。抗CD-IC抗体：i，70.1；ii，反-爪蟾CD-IC肽抗体；iii、，爪蟾-特定NH₂-末端抗体。添加的猪脑运动部件（◂）的位置和爪蟾第150页*^胶水*和CD-IC裂解产物（3）如图所示。与图8相反，分析的是总样品，而不是再隔离膜。

图8
凋亡膜可以募集完整的细胞质动力蛋白和动力蛋白。将来自对照组（C）或凋亡组（A）鸡蛋提取物的膜在对照组或凋亡细胞液中孵育1小时。然后回收膜，并在SDS-PAGE和免疫印迹上运行相同的蛋白质样品（使用抗核糖蛋白作为负荷对照）。

**图10**
显示CD-IC和p150预测效果的图表*^胶水*细胞质动力蛋白驱动的细胞器运动的分裂。裂开导致p150的移除*^胶水*-CD-IC的结合结构域，使细胞质动力蛋白不能与其货物结合，从而不能移动其货物。p150的裂解*^胶水*发生得较慢，去除了dynactin复合体的微管结合能力，这可能确保货物无法与微管结合。我们的结果表明，p50动态蛋白也部分从货物中释放出来（模型中未显示）。

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