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.2001年6月11日；153(6):1209-26.
doi:10.1083/jcb.153.61209。

秀丽隐杆线虫动粒组装的功能分析

K Oegema公司 1, A德赛, S瑞比纳, M柯克汉姆, A Hyman公司
附属公司

秀丽隐杆线虫动粒组装的功能分析

K Oegema公司等人。 J细胞生物学. .

摘要

在所有真核生物中，有丝分裂染色体的分离需要它们与纺锤形微管的相互作用。为了剖析这种相互作用，我们在单细胞阶段秀丽隐杆线虫胚胎中使用活的和固定的分析。我们比较了着丝粒组蛋白CENP-A、动粒结构成分CENP-C和染色体乘客蛋白INCENP同源物耗尽的后果。CeCENP-A或CeCENP-C的耗尽导致相同的“动粒缺失”表型，其特征是有丝分裂染色体分离完全失败，以及无法招募其他动粒成分和组装机械稳定的纺锤体。它们耗竭表型的相似性，加上CeCENP-a定位CeCENP-C的要求，而不是相反，表明动粒组装的一个关键步骤是CENP-a-染色质招募CENP-C。对缺乏CeINCENP的胚胎进行的平行分析显示，有丝分裂染色体分离缺陷不同于在没有CeCENP-A/C的情况下观察到的缺陷。缺陷出现在胚胎发育后期和之前，但染色质分离成两个大小相等的肿块。机械稳定的纺锤组装，在后期和末期显示缺陷。此外，动粒组装和CeINCENP向染色体的募集是独立的。这些结果表明，动粒和染色体乘客在有丝分裂染色体分离中具有不同的作用。

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数字

图1
图1
CeCENP-A和CeCENP-C共定位于单细胞期的弥散动粒秀丽线虫胚胎。（A） 对野生型胚胎进行染色，以显示DNA（青色）、MT（红色）、Ce-CENP-A和CeCENP-C秀丽线虫胚胎如图所示。在早期前期和前期面板中，精子源性原核和相关中心体紫苑位于右侧，卵母细胞源性原细胞核位于左侧。Ce-CENP-A中期和后期面板中的弱纺锤极染色是非特异性的。（B） 高倍镜下的细胞核DNA和CeCENP-C染色板。左边的板显示了前核相遇前的前核。CeCENP-C定位于沿着部分浓缩染色体的斑片状条纹。右边的面板显示了原核相遇后，核膜破裂后的原核。此时，CeCENP-C定位在完全浓缩染色体相对面上的两个板上。所有图像都是三维堆栈的投影。棒材：（A）5μm；（B） 1微米。
图2
图2
CeCENP-A或CeCENP-C的耗尽会导致类似的染色体分离缺陷。小组总结了胚胎表达GFP组蛋白的视频。图中显示了野生型胚胎（左）、CeCENP-a缺失胚胎（中）和CeCENP-C缺失胚胎的静像。每个面板右上角的时间是NEBD后的秒数。所有序列的方向都是胚胎左前，右后，这取决于精子进入的位置。在CeCENP-A或CeCENP-C缺失的胚胎中，母染色体和父染色体形成单独的紧密染色体团，无法分布在纺锤形赤道上，并且在后期无法分离。插图显示了中期纺锤体的正面。相对于其他面板，嵌入部分放大了3.4倍。在线补充视频可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/153/6/1209/DC1。棒材，5μm。
图3
图3
CeCENP-C定位到染色体需要CeCENP-A，反之则不需要。固定并染色野生型、CeCENP-A或CeCENP-C缺失的胚胎，以可视化DNA（青色）、MT（红色）、CeCENP-A和CeCENP-C。显示中期胚胎（A）和前期/前中期细胞核（B）的高倍视图。任何成分的RNAi都会将其降低到免疫荧光检测不到的水平。CeCENP-A缺失胚胎纺锤极染色的持续性表明这种染色是非特异性的（另见图10C）。在没有CeCENP-A（A和B，中间行）的情况下，CeCENP-C在前期可见于细胞核中，但在有丝分裂的任何时候都没有观察到与染色体相关。相反，在没有CeCENP-C的情况下，CeCENP-A在整个有丝分裂过程中与染色体相关（A和B，底行）。所有图像都是三维堆栈的投影。棒材，5μm。
图6
图6
在后期发病之前，极性提示力开始将纺锤体向胚胎后部移动。（A） 视频中的静像秀丽线虫表达GFP组蛋白的胚胎标记DNA，表达GFP–γ-微管蛋白标记纺锤体极。胚胎前部（Ant）位于左上方，胚胎后部（Post）位于右下方。每个面板右上角的时间（以秒为单位）与后期发作相关。作为参考，第一个时间点（−64s）的主轴中心位置（箭头）和两个主轴极（箭头）标记在随后的三个面板上。（B） 绘制纺锤体中心和胚胎后部之间的距离（表示为卵子长度的一部分）。纺锤体大约有一半的后部运动发生在后期发病之前。（C） 第一次有丝分裂过程中的染色体分离秀丽隐杆线虫胚胎主要是由后期B引起的。染色体对极距离（黑色三角形）、染色体分离变化（中灰色圆圈）和极对极距离变化（浅灰色方格）是相对于后期开始绘制的。染色体分离是沿着极-极轴测量的分离染色体极边缘之间的距离。在后期发病前4 s减去相关值，得到染色体分离和极距的变化。在线补充视频可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/153/6/1209/DC1。棒材，5μm。
图4
图4
CeMCAK和CeBub1是秀丽线虫对野生型胚胎进行染色，以显示DNA（青色）、MT（红色）、CeMCAK和CeBub1。图中显示了第一次胚胎分裂的不同阶段。所有图像都是三维堆栈的投影。棒材，5μm。
图5
图5
CeMCAK和CeBub1都需要CeCENP-C靶向染色体。固定并染色野生型或CeCENP-C缺失的胚胎，以同时显示DNA（青色）、MT（红色）、CeCENP-C以及CeBub1（A）或CeMCAK（B）。CeCENP-C耗尽至无法检测到的水平（未显示）。CeMCAK的中心体定位和CeBub1的核积累发生在CeCENP-C缺失的胚胎中。然而，在任何有丝分裂阶段，这两种蛋白都不定位于染色体。在CeCENP-A缺失胚胎中CeBub1和CeMCAK定位分析中获得了相同的结果（未显示）。所有图像都是三维堆栈的投影。棒材，5μm。
图7
图7
机械稳定的纺锤体不会在缺乏CeCENP-A或CeCENP-C的胚胎中组装。NEBD之后的时间（以秒为单位）显示在每个面板的右上角。在没有CeCENP-C的情况下，MT在NEBD后侵入核空间，但无法形成稳定的纺锤，纺锤极突然分开。在CeCENP-A缺失的胚胎中获得了相同的结果（此处未显示）。（B） 野生型（钻石）和CeCENP-C缺失型（方形）胚胎的极分离。每个条件绘制三个序列。灰色箭头表示NEBD后的平均时间，此时纺锤在野生型中开始向后运动。黑色箭头表示野生型中后期发病的平均时间。在CeCENP-C缺失胚胎中，两极在箭头标记的间隔期间突然分离。（C） 对于每个实验条件，确定了极点分离的最大速率。绘制了每个条件下五个视频分析的平均值±标准差。野生型和CeCENP-C/CeCENP-A消耗之间的最大磁极分离率存在显著差异(P（P）=<0.001和P（P）=<0.05，在学生的t吨试验），但CeCENP-A和CeCENP-C消耗量之间没有显著差异。在线补充视频可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/153/6/1209/DC1。棒材，5μm。
图8
图8
CeINCENP定位于两个动粒板之间的染色体区域。（A） 对野生型胚胎进行染色，以同时显示DNA（青色）、MT（红色）、CeINCENP和CeCENP-A。显示了第一次有丝分裂的不同阶段。在第一排，母体原核在左侧，父体原核位于右侧。CeINCENP在母体原核早期的定位比父体原核更显著。（B） A前中期细胞核的高倍镜显示CeINCENP定位于两个动粒板之间的染色体区域。所有图像都是三维堆栈的投影。棒材：（A）5μm；（B） 1微米。
图9
图9
RNAi对CeINCENP的消耗导致了与CeCENP-A/C消耗不同的缺陷。A和B中的时间是NEBD之后的秒数。（A） 视频中一个CeINCENP缺失的胚胎表达GFP-组蛋白。卵母细胞核减数分裂失败，左侧产生有缺陷的母体原核。来自右侧减数分裂正常父核的染色体浓缩，但不能正确排列。染色质的超前和滞后出现在后期。然而，总是可以观察到这些染色体分离成两团（箭头）。（B） 视频中一个CeINCENP缺失的胚胎表达GFP–α-微管蛋白。相对于CeCENP-A/C消耗，形成了更坚固的主轴（将此处的120秒和185秒与图7A中的120秒与176秒CeCENP-C面板进行比较）。在后期，纺锤状中区未能形成，与CeCENP-a/C缺失不同，胞质分裂失败（C）CeINCENP-缺失的胚胎被固定并染色DNA（青色）和MT（红色）。母体原核的染色体在纺锤体附近形成一大块。偶尔，该肿块不在纺锤附近（例如，在底部末端面板中）。与A中的实时分析一样，父系染色体在后期未能与紧密板对齐，并显示出领先和滞后的染色质，但总是分离成两个大小相等的团（箭头）。所有图像都是3D堆栈的投影。（D） 野生型（钻石）和去CeINCENP（方形）胚胎的极分离。分别绘制了三个序列。（E） 在野生型和CeINCENP RNAi胚胎之间，极性分离的最大速率没有显著差异。五个视频分析的平均值±SD绘制在图7中野生型值旁边。在线补充视频可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/153/6/1209/DC1。棒材，5μm。
图10
图10
CeINCENP的染色体结合和动粒组装是独立的过程。（A） 将野生型或CeINCENP缺失的胚胎固定并染色，以可视化DNA（青色）、MT（红色）、CeCENP-A和CeINCENP。CeINCENP耗尽到免疫荧光检测不到的水平。然而，CeCENP-A定位于浓缩有丝分裂染色体。（B） 将去CeINCENP的胚胎固定并染色，以显示DNA、MT、CeINCENP和CeBub1（顶部）或CeMCAK（底部）。CeINCENP耗尽至无法检测到的水平，如A所示（未显示）。两行中的右侧面板显示较高的放大视图。CeBub1和CeMCAK在没有CeINCENP的情况下定位于浓缩的父系染色体，并形成外观正常的动粒板。这两个标记对减数分裂缺陷母体的定位较弱或缺失。（C） 一个CeCENP-A缺失的胚胎，DNA（青色）、MT（红色）、CeCENP-A和CeINCENP染色。CeCENP-A被耗尽到无法检测到的水平，但CeINCENP仍然定位于染色体。棒材：（A）5μm；（B，左侧和中部）5μm；（B，右）1μm；（C） 5微米。
图11
图11
动粒组装过程中的依赖关系综述秀丽线虫表型相似性和依赖性结果表明，动粒组装中的一个关键中间产物是通过染色体相关的CeCENP-a直接或间接招募Ce-CENP-C。CeBub1和CeMCAK显示在CeCENP-C下游的不同路径上（见正文）。箭头表示动粒组装期间的依赖关系，并不表示组件之间的直接相互作用。我们的结果还表明，CeINCENP的染色体关联和动粒组装是独立的过程。AIR-2的依赖关系秀丽线虫CeINCENP和BIR-1上的极光B激酶源自其他小组的工作（Adams等人2000年；Kaitna等人2000年，Speliotes等人2000）。
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    1. Adams R.R.、Wheatley S.P.、Gouldsworthy A.M.、Kandels Lewis S.E.、Carmena M.、Smythe C.、Gerloff D.L.、Earnshaw W.C.INCENP结合极光相关激酶AIRK2，并需要将其靶向染色体、中心纺锤体和卵裂沟。货币。《生物》2000；10:1075–1078.-公共医学
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