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.2001年6月5日；98(12):6865-70.
doi:10.1073/pnas.121455098。 Epub 2001年5月29日。

促炎性细胞因子调节人类糖皮质激素受体基因表达并导致显性负β亚型的积聚：糖皮质激素抵抗产生的机制

J C韦伯斯特 1, R H奥克利, C M珠宝, J A西德洛夫斯基
附属公司

促炎细胞因子调节人类糖皮质激素受体基因表达并导致显性负β亚型的积累：糖皮质激素耐药性的产生机制

J C韦伯斯特等。 美国国家科学院程序. .

摘要

许多细胞类型的炎症反应由NF-kappaB和糖皮质激素受体（GR）的相反作用协调调节。人类糖皮质激素受体（hGR）基因编码两种蛋白质亚型：一种是细胞质α型（GRalpha），它结合激素，易位到细胞核，并调节基因转录；另一种是核定位β亚型（GRbeta），它不结合已知配体，并减弱GRalpha的作用。我们在这里报告了对hGR启动子的肿瘤坏死因子（TNF）反应性NF-kappaB DNA结合位点5'的鉴定，该位点导致HeLaS3细胞中GRalpha mRNA增加1.5倍，GRbeta mRNA增加2.0倍，这两种细胞都内源性表达GR亚型。然而，TNF-α治疗不成比例地增加了GRβ蛋白亚型相对于GRα的稳态水平，使GRβ成为主要的内源性受体亚型。用TNF-α或IL-1治疗人CEMC7淋巴细胞后，也观察到类似的结果。GRbeta蛋白表达的增加与糖皮质激素抵抗的发展相关。

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图1
图1
细胞因子治疗后GRβ特异性mRNA增加。来自的总RNA分离HeLaS3细胞，并对总计0.5μg的细胞进行RT-PCR使用hGRα-和hGRβ-特异性引物对每个治疗组进行RNA检测。肌动蛋白特异性引物被用作内部对照。
图2
图2
利用异构体特异性对GR异构体进行免疫染色表位纯化的多克隆抗体。(A类)HeLaS3细胞用1 ng/ml TNF-α或载体治疗24小时，然后100 nM地塞米松治疗1小时（TNF）或溶媒（第页）。按照描述（14、21、23、24）固定和处理细胞。(B类)荧光染色的图像分析是使用NIH Image 1.56执行。平均峰值强度为计算每种亚型是否接触TNF。
图3
图3
细胞因子治疗后GR亚型水平的西方分析。(A类)HeLaS3细胞被增加TNF-α浓度（0.1至100 ng/ml）持续24小时α特异性AShGR和β特异性BShGR抗体用于西方分析。(B类)蛋白质印迹的定量显示了三个单独实验的平均值（SEM）。(C类)用1 ng/ml TNF-α处理HeLaS3细胞0、12、24或48小时。制备并分析全细胞提取物如上所述。(D类)以a形式给出的结果的量化三个实验的平均值（SEM）。
图4
图4
GRβ优先上调发生在其他细胞类型中其他细胞因子。(A类)HeLaS3细胞和CEMC7细胞未经治疗或用TNF-α（1 ng/ml）或IL-1（10 ng/ml24 h制备全细胞提取物，并用Western使用AShGR和BShGR抗体进行分析。(B类)氦镧S3用TNF-α或载体处理细胞24或48小时。整体制备细胞提取物并用Western blot分析针对两者共同表位的抗人生长激素受体抗体（57号）GRα和GRβ。
图5
图5
人糖皮质激素中NF-κB共识序列的定位受体启动子。(A类)NF-κB共识的位置与hGR转录起始位点（+1）相关的序列启动子（2）。AP-1站点也已指定。NF-κB的序列还显示了该站点。(B类)COS1细胞转染pBR322（MOCK）或NF-κB共识序列与异源胸腺嘧啶核苷激酶启动子驱动a的表达荧光素酶报告子（NF-κB-tk-LUCtk-LUC加上p65或单独使用tk-LUC。荧光素酶分析表明三次转染的平均值。
图6
图6
肿瘤坏死因子-α后GRα和GRβmRNA及蛋白的半衰期研究治疗和下调受体蛋白以应对糖皮质激素。(A类)HeLaS3细胞被用于用1 ng/ml TNF-α24小时，然后用放线菌素D处理1小时。在不同的时间间隔获得mRNA，并通过RT-PCR使用α-异形或β-异形特异性引物进行。(B类)HeLaS3细胞用1 ng/ml处理24 h然后用环己酰胺处理TNF-α1小时。整个细胞在不同的时间间隔获得提取物，西方分析使用AShGR或BShGR抗体进行。(C类)用hGRα或hGRβ转染COS1细胞。16小时转染后，用100 nM DEX或载体处理细胞（CON）24小时。制备细胞提取物，并测定GR蛋白水平用57号抗体进行Western分析。
图7
图7
激素介导的反式激活在用细胞因子。(A类)HeLaS3细胞瞬时转染带有糖皮质激素诱导报告质粒GRE2-TATA-CAT。细胞单独使用载体（CON）、100 nM DEX、1纳克/毫升TNF-α或1纳克/毫克TNF-地塞米松1小时（TNF-α+DEX）。制备细胞提取物并检测CAT活性。(B类)内源性采用相同的处理方法分析碱性磷酸酶活性上述方案。(C类)西方对核能和TNF-α作用0、1和24小时后p65的细胞质水平治疗。
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