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.2001年4月；75(8):3647-56.
doi:10.1128/JVI.75.8.3647-3656.2001。

甲型流感病毒M2离子通道蛋白质子选择性和阿托安培单位电流的确定分配

T I林 1, C施罗德
附属公司

甲型流感病毒M2离子通道蛋白质子选择性和阿托安培单位电流的确定分配

T I林等人。 J维罗尔. 2001年4月.

摘要

病毒离子通道蛋白M2支持流感病毒及其糖蛋白通过细胞酸性隔室的转运。M2将内胚体质子导入病毒粒子以启动脱膜，并通过平衡反高尔基膜的pH值，保持酸性敏感性病毒血凝素的天然构象。M2通道的极低电导阻碍了电生理技术对单个通道的分辨。脂质体再合成M2的分析得出M2四聚体的平均单一通道电流——在中性pH下为1.2 aA（1.2 x 10（-18）A），在pH 5.7下为2.7至4.1 aA，激活通道。对生理温度的外推预测分别为4.8和40 aA，单位电导分别为0.03和0.4 fS。这种微小的活性，低于先前的估计，似乎足以使病毒繁殖，但低到足以避免流产的细胞毒性。M2的单位渗透率在其他质子通道的报道范围内。为了解决M2的离子选择性问题，我们利用了封闭脂质体中离子内流和外流的耦合。金属离子通量通过质子逆流监测，使用的pH探针比可用的Na+或K+探针灵敏1000倍。即使是低氢激活的M2也不能传导Na+和K+。M2的质子选择性估计至少为3 x 10（6）（钠离子或钾离子），与电生理研究一致。M2严格的质子选择性表明，流感病毒的细胞病理学并不涉及细胞钠或钾梯度的直接扰动。

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数字

图1
图1
分离和脂质体重组M2蛋白的特性。（A） M2制剂（I、II和III）的SDS-PAGE（12.5%聚丙烯酰胺）用考马斯蓝染色。左车道：Amersham RPN800分子质量标记（单位：千道尔顿）。（B） 用抗血清显影到M2 N端（左侧）或C端（右侧）的相同凝胶的对齐免疫印迹。1、单体；二聚体；4，四聚体。（C） 天然1%琼脂糖凝胶。车道1，500 ng M2加上40 mM OG；通道2，蛋白质标准HDL-LDL；车道3，250 ng M2加上0.34%考马斯蓝；通道4、250 ng M2、0.05%牛磺脱氧胆酸和40 mM OG。在右侧面板中，用胆固醇检测试剂盒对凝胶进行染色，以可视化第2通道中的蛋白质标准（LDL位于上带，HDL位于下带）。车道3显示了预涂M2和未粘合考马斯蓝，前面用一条线表示。左面板显示用抗M2兔血清开发的对齐Western blot，装载袋。（HDL-LDL标准物包含一个迁移至阴极的非特定反应带。）（D）脂质体重组M2的方向。用NaPS（Na+)或KPS（K+)在无（+）或有40 mM OG（OG）的情况下用胰蛋白酶消化，未经处理的对照（−）进行斑点杂交，并用M2 N末端（上部）或C末端（下部）的抗血清进行培养。
图2
图2
M2活性和离子选择性分析的实验装置。（A） 将含有钾离子或钠离子和荧光pH指示剂的M2囊泡引入分析缓冲液中，该缓冲液施加金属离子或pH梯度。M2蛋白在两个方向上都存在。通过内部pH值监测与质子逆流耦合的金属离子通量。将含有钠离子的M2囊泡引入含有钾离子的缓冲液中。如果没有观察到pH值的变化，则添加一个针对内部金属离子的离子载体，以引发质子通量（箭头所示）。添加莫能菌素（m）支持钠的逃逸+离子，使质子通过M2流入。（C） 对外部金属离子特异性的离子载体缬氨酸霉素（v）的添加支持K+离子流入，使质子流出M2。（D） 将M2囊泡引入缺乏两种金属离子的缓冲液中。
图3
图3
钠存在下M2离子通道的阳离子选择性+和K+离子。（A） 将含有NaPS的M2（固体符号）或对照囊泡（开放符号）引入Na+-或K+-包含缓冲区。（B） 将含有KPS的M2（固体符号）或对照囊泡（开放符号）引入Na+或K+缓冲区。根据时间绘制荧光监测的内部pH值；膜外部的初始pH值为7.4。实验设置在图2C和D的图例中进行了解释。离子载体的添加由箭头指示。培养缓冲液和添加的电离层显示在框中。缬氨酸，缬氨酸霉素；mon，monensin。
图4
图4
单一金属离子存在时M2离子通道的阳离子选择性。将含有NaPS（A）或KPS（B）的M2或对照囊泡引入无金属离子NMDGH缓冲液中，如图2D所示。10秒后添加莫能菌素（A）或缬氨霉素（B）（箭头所示）。ΔpH=pH在里面−pH在里面(t吨=0秒）。膜两侧的初始pH值为7.4。其他符号如图3图例所示。
图5
图5
酸性pH值对M2离子通道蛋白阳离子选择性的影响。将在NaPS（pH 7.4）中制备的囊泡引入pH 5.7的NaPS或KPS中。数据显示为M2囊泡和对照（c）囊泡记录之间的差异图：ΔpH=pH在里面（M2）−pH在里面（c） ●●●●。20秒时添加离子孔（箭头所示）。培养条件：▴，KPS，pH 5.7（加缬霉素）；■, NaPS，pH 5.7（加莫能菌素）；●, KPS，pH 5.7（加莫能菌素）。
图6
图6
金刚乙胺对M2质子通道活性的抑制作用。在KPS（pH 7.4）中制备的囊泡在18°C下与1μM金刚乙胺一起引入NaPS（pH 7.4）中，并培养5分钟（●），然后添加安定霉素以启动质子移位。通过向含有缬霉素和金刚乙胺的NaPS中引入囊泡，观察到无预孵育的抑制作用（○）。在NaPS（pH 7.4）中记录无抑制反应（▵），在KPS（pH 7.4）中记录背景（▵）。
图7
图7
质子移位率的温度依赖性。（A） 质子移位到M2和控制（c）囊泡。ΔpH=pH在里面(t吨=0）−pH在里面(t吨=1秒）。（B） 阿伦尼乌斯阴谋。初始质子移位率(v（v）[M秒−1])根据ΔpH计算在里面如表1所述；日志v（v）与1作对/T型.
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