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。2001年3月19日；193(6):741-54.
doi:10.1084/jem.193.6.741。

小鼠条件性血管细胞粘附分子1缺失：淋巴细胞向骨髓迁移受损

P A科尼 1, S K乔希, U A Temann先生, D奥尔森, L伯克利, R A Flavell公司
附属公司

小鼠条件性血管细胞粘附分子1缺失：淋巴细胞向骨髓迁移受损

P A科尼等。 实验医学杂志。 。

摘要

我们生成了血管细胞粘附分子（VCAM）-1“敲除”小鼠和Cre重组酶转基因小鼠，以删除整个小鼠中的VCAM-1基因（VCAM-1），从而克服了传统VCAM-1缺陷小鼠的胚胎致死性。vcam-1敲除小鼠表达正常水平的vcam-1，但与“TIE2Cre”转基因杂交后，内皮细胞和造血细胞上vcam-1丢失。对条件型vcam-1缺乏小鼠外周血的分析显示轻度白细胞增多，包括未成熟B细胞数量增加。相反，骨髓（BM）减少了未成熟B细胞数量，但前B细胞数量正常。vcam-1缺陷小鼠骨髓中成熟IgD+B和T细胞减少，支持转移的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和预激活的CD4+T细胞短期迁移至骨髓的能力大大降低。因此，我们报告了迄今为止vcam-1在淋巴细胞归巢至骨髓中的主导作用。

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图1
图1
目标策略和有条件删除vcam-1型弗洛克斯等位基因。（A） VCAM-1敲除小鼠（底部基因座图）包含重组的Cre重组酶位点(液氧磷地点；黑色箭头）。这个vcam-1型编码序列外显子被描述为条纹条，5′非翻译区为白色条。探头A和B在顶部地图线上方显示为黑色条。内切酶位点显示为BamHI（B）、EcoRI（R）、HindIII（H）、SphI（S）和XhoI（X）。（B） vcam-1型新等位基因（neo）和Cre重组酶介导的缺失可能产生的两种结果，即vcam-1型弗洛克斯等位基因（flox）和vcam-1型 Δ等位基因（Δ）。（C和D）分别使用探针A和B对尾部DNA进行BamHI Southern blot分析。删除vcam-1型新等位基因产生vcam-1型弗洛克斯等位基因（flox）和vcam-1型 Δ全小鼠的等位基因（Δ）是通过与拼接器转基因。（E） 小鼠尾部DNA的Southern blot分析vcam-1型弗洛克斯/Δ鼠标（轨迹1）显示在两个TIE2Cre旁边+出生于vcam-1型flox/flox公司父母，但使用TIE2Cre+父母是父亲（第2轨）或母亲（第1轨和第3轨）。（F和G）Southern blot分析vcam-1型flox/flox公司/TIE2核心+鼠标和vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+鼠标。分析的组织为：BM；Br，大脑（皮层）；H、 心脏；Ki，肾脏；李，肝脏；卢，肺；LN；M、 肌肉（大腿）；Pa，胰腺；Sp和脾脏。
图2
图2
Cre重组酶介导的内皮细胞和造血细胞缺失。（A） 肺切片显示的是vcam-1型 +/+鼠标（WT）和vcam-1型flox/flox公司/TIE2Cre公司+OVA致敏和气雾剂激发后的小鼠（KO）。每个面板中显示了一条具有代表性的血管（箭头）；原始放大倍数：×500。血管内皮细胞可见VCAM-1染色vcam-1型 +/+小鼠肺（红色），但在vcam-1型flox/flox公司/TIE2Cre公司+小鼠肺。（B） 在BM B220上评估VCAM-1（开放直方图）−髓系细胞（即不包括高侧散射颗粒细胞和低前散射红细胞，脾CD11c+CD8a型−髓系DC和脾脏CD11c+CD8a型+通过荧光细胞术检测淋巴DC。使用抗CD8b.2（克隆53-5.8）作为同型对照（阴影直方图）。CD8b.2的小峰+CD11c中的细胞+CD8a型+脾细胞是意料之中的事，因为已知一小部分CD8+T细胞为CD11c+。
图2
图2
Cre重组酶介导的内皮细胞和造血细胞缺失。（A） 肺切片显示的是vcam-1型 +/+鼠标（WT）和vcam-1型flox/flox公司/TIE2Cre公司+OVA致敏和气雾剂激发后的小鼠（KO）。每个面板中显示了一条具有代表性的血管（箭头）；原始放大倍数：×500。血管内皮细胞可见VCAM-1染色vcam-1型 +/+小鼠肺（红色），但在vcam-1型flox/flox公司/TIE2Cre公司+小鼠肺。（B） 在BM B220上评估VCAM-1（开放直方图）−髓系细胞（即不包括高侧散射颗粒细胞和低前散射红细胞，脾CD11c+CD8a型−髓系DC和脾脏CD11c+CD8a型+荧光细胞术检测淋巴树突状细胞。使用抗CD8b.2（克隆53-5.8）作为同型对照（阴影直方图）。CD8b.2的小峰+CD11c中的细胞+CD8a型+由于已知CD8的一小部分+T细胞是CD11c+。
图3
图3
TIE2Cre转基因激活ROSA26R报告基因等位基因，并导致大脑（Br）、肾脏（Ki）、肝脏（Li）、腋窝淋巴结（LN）、脾脏（Sp）和胸腺（Th）中的β-半乳糖苷酶活性，通过蓝色X-Gal染色显示（原始放大倍数：×100）。脑切片厚度为30μm，而其他所有切片均为10μm。例如，脾脏切片中的粗箭头和细箭头分别表示一些较大的血管和小动脉。
图4
图4
外周血分析显示白细胞增多vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+老鼠。代表性实验(n个=每组5人），年龄和性别匹配vcam-1型flox/flox公司老鼠（黑条），vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre−老鼠（条纹条）及其vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+室友（白色酒吧）。白细胞总数是从Turk’s溶液中EDTA处理的血液中测定的，以每毫升血液中数百万个细胞为单位。通过荧光细胞术建立差异计数。PMN的定义基于高侧向散射，其他细胞被定义为单核细胞。CD4的数量+T细胞，IgD洛免疫球蛋白M你好未成熟B细胞和IgD+右图所示的B细胞不是单核细胞计数的补充，而是后者的一部分。之间的显著差异vcam-1型flox/flox公司小鼠和vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+指示小鼠（学生的t吨测试*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01).
图5
图5
骨髓中淋巴细胞减少vcam-1型弗洛克斯 / Δ/TIE2Cre公司+老鼠。（A） B220的代表性IgD与IgM图谱+BM中的细胞vcam-1型flox/flox公司鼠标和vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+显示IgD降低的小鼠洛免疫球蛋白M你好未成熟B细胞和IgD+后者为B细胞。（B和C）年龄和性别匹配的BM中的绝对淋巴细胞数vcam-1型flox/flox公司老鼠（黑条）和vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+鼠标（白色条），显示正常B220+CD43细胞+原B细胞数量减少，但其他类型的淋巴细胞数量减少。两组之间的显著差异(n个=4个）（学生的t吨测试*P（P）< 0.02; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.002).
图6
图6
相对正常的B细胞反应vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+老鼠。连续脾切片vcam-1型flox/flox公司鼠标（WT）和vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+小鼠（KO）腹腔注射NP后10天13吸附到明矾上的CG（原始放大倍数：×100）。所有切片均用抗IgD抗体（棕色）和PNA、抗CD8b或抗VCAM-1染色。PNA、CD8b和VCAM-1染色呈紫色。KO部分中的箭头表示GC内FDC上典型的VCAM-1染色。
图7
图7
减少短期淋巴细胞向骨髓的迁移vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+老鼠。年龄和性别匹配的代表性实验vcam-1型flox/flox公司收件人（黑色条）和vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+收件人（白色条）。CMFDA标记细胞（IgD）的频率+，CD4+和CD8a+)用于确定每个淋巴器官中每种CMFDA标记细胞的绝对数量。然后将这些数据表示为宿主细胞的百分比，其中100%是每只小鼠中回收的CMFDA标记细胞的总数(n个=每组3人）*与控制显著不同（学生的t吨测试，P< 0.02). 向PLN的迁移略有增加vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIES2核心+受试者无统计学意义。
图8
图8
B细胞再循环至BM受损会导致外周血水平升高。年龄和性别匹配vcam-1型flox/flox公司收件人（黑色条）和vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+受体（白色条）接受CMFDA标记的脾细胞列车控制室α− /−2小时后采集供体和受体淋巴器官和血液(n个=每组4人）。CMFDA标记细胞的IgD与IgM图谱如图5A的图例所示，并使用CMFDA-标记细胞的频率来确定每个淋巴器官中每种类型的CMFDA标签细胞的绝对数量。指出了重大差异（学生的t吨测试*P（P）< 0.01; **P（P）< 0.005; ***P（P）< 0.001).
图9
图9
通过预激活CD4减少短期迁移+T细胞。年龄和性别匹配vcam-1型flox/flox公司收件人（黑色条）和vcam-1型弗洛克斯/Δ/TIE2Cre+受体（白色条）接受CMFDA标记的预激活/有经验的T细胞，如材料和方法中所述，2小时后采集受体淋巴器官和血液(n个=每组4人）。通过荧光细胞术测定CMFDA标记细胞的CD4与CD62L的图谱，并使用CMFDA标记细胞的频率来确定每个淋巴器官中每种类型的CMFDA标记细胞的绝对数量（注意尺度上的差异）。指出了重大差异（学生的t吨测试*P（P）<0.002）。
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