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.2001年1月15日；20(1-2):272-84.
doi:10.1093/emboj/201.272。

一种新的与细胞骨架成分共分布的网格蛋白同源物在反高尔基网络中的功能

S H刘 1, M C拖车, E Chen先生, C Y Chen先生, W歌曲, G阿波达卡, F M Brodsky先生
附属公司

一种新的与细胞骨架成分共分布的网格蛋白同源物在反高尔基网络中的功能

S H刘等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

与编码在17号染色体上的传统网格蛋白重链（CHC17）相比，编码在人类22号染色体（CHC22）上的网格蛋白同源物显示出不同的生物化学、分布和功能。CHC22蛋白在成肌细胞分化为肌管期间上调，相对于CHC17，在肌肉中高水平表达，在非肌肉细胞中低水平表达。三聚体CHC22蛋白不与网格蛋白重链亚基相互作用，也不与网格素轻链显著结合。CHC22与AP1和AP3适配器复合体相关，但与AP2无关。在非肌肉细胞中，CHC22定位于核周囊泡结构，其中大多数没有氯氰菊酯涂层。破坏肌动蛋白细胞骨架或影响跨高尔基网络（TGN）分类的治疗会导致CHC22重新分布。CHC22亚结构域的过度表达导致TGN标记的分布改变。总之，这些结果表明CHC22参与TGN膜交通，涉及细胞骨架。

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图1。CHC22在人成肌细胞和肌肉组织中的表达。(A类)肌肉分化过程中CHC22的诱导。在低血清培养基中诱导人骨骼肌成肌细胞SKMC分化。血清减少后，在指定的日期采集细胞，并使用CHC22特异性单克隆抗体从细胞裂解液（调整到相同的蛋白浓度）中免疫沉淀CHC22蛋白。免疫沉淀用SDS-PAGE溶解，CHC22用纯化的抗CHC22抗血清（CHC22）通过免疫印迹法检测。通过用CHC17特异性MAb TD.1（CHC17）印迹检测相同裂解物中普遍存在的网格蛋白重链CHC17的表达水平。(B类)分化的人类成肌细胞的免疫荧光。在低血清培养基中诱导生长在胶原涂层盖玻片上的SKMC细胞分化为（A）中的细胞7天。然后使用特异性单克隆抗体（MAb）和罗丹明（LRSC）结合的山羊抗鼠IgG，通过免疫荧光分析细胞CHC22的分布，并使用抗氯氰菊酯轻链抗血清α-cons和FITC-结合的山羊抗兔IgG分析常规CCV（氯氰菊酯LC）。注意，并非所有细胞都分化，只有多核细胞表达可检测到的CHC22水平。(C类)CHC22和网格蛋白在人体骨骼肌中的分布。制备正常人肌肉的组织切片用于免疫荧光，并如（B）中那样标记CHC22（红色）和网格蛋白轻链（氯氰菊酯LC，绿色）。三个面板显示了用不同滤镜观察的相同样本，底部面板显示了两种抗体的合并染色。箭头表示容易观察到缺乏共同定位（单独的红色和绿色染色）的区域（见正文），而黄色信号表示染色模式重叠。
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图2。CHC22与氯氰菊酯外壳成分的差异关联。(A类)用Superose 6大小排阻色谱分离含有重组CHC22Hub和共表达牛神经元LCa的细菌裂解物。收集柱馏分并通过SDS–PAGE按顺序（从左到右）进行解析。CHC22Hub多肽或LCa的存在是通过使用针对CHC22的兔血清（CHC22Hub）或MAb CON.1的免疫印迹来确定的，其识别两个轻链（LCa和LCb）共享的决定簇。顶部的箭头表示分子量标准过氧化氢酶（232 kDa）洗脱位置两侧的部分。(B类)用Superose 6大小排阻色谱分离含有重组CHC22Hub和共表达牛神经元LCb的细菌裂解液，并分析CHC22Hub多肽和LCb的洗脱位置，如（A）所示。(C类)制备了HeLa 229细胞的细胞溶胶和膜富集组分。然后使用CHC22特异的MAb从每个组分中免疫沉淀CHC22。使用MAb X22分离传统的网格蛋白重链（CHC17）（Blank和Brodsky，1986）。然后将免疫沉淀物进行SDS-PAGE并用以下抗体进行检测：抗CHC22多克隆抗血清[CHC22（PAb）]、CHC17-特异性单克隆抗体TD.1、抗网格蛋白轻链抗血清（CLC）、抗AP1γ亚基单克隆抗体100/3[AP1（γ）]、抗AP2α亚基AC1M11[AP2（α）]和抗AP3β3抗血清[AP3（β）]。CHC17免疫沉淀物中的CHC22信号是由于X22与CHC22的交叉反应，导致CHC22与CHC17共沉淀，并可能解释AP3与CHC17.的明显关联。(天)在tet操作（pJM601CHC22）下，用T7表位标记的全长CHC22永久性转染HeLa-tet/on细胞，并用强力霉素诱导CHC22表达24 h。然后使用抗T7单克隆抗体对CHC22全长蛋白进行免疫沉淀，并通过SDS-PAGE和免疫印迹分析样品，以使用特定的多克隆抗血清检测CHC22，或使用α-cons多克隆抗体检测网格蛋白轻链（CLC）。使用MAb X22从同一样品中免疫沉淀常规氯氰菊酯（CHC17），并进行类似分析。注意，由于交叉反应，X22免疫沉淀一些CHC22和CHC17（见C）。
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图3。CHC22与AP1和AP3但不与AP2共调校。感染pLNCXCHC22以获得低水平CHC22增强表达的HeLa细胞用0.004%洋地黄素处理，以便在进行免疫荧光处理之前去除胞浆蛋白。然后用CHC22 MAb（同型IgG2a）将细胞染成红色，然后用生物素化山羊抗小鼠IgG2抗体和LRSC结合的链霉亲和素染色(A类和G公司). 用单克隆抗体100/3和AP.6在绿色中检测AP1和AP2，然后用FITC-结合山羊抗IgG2b(B类)和IgG1(H（H）)抗体。使用抗CHC22单克隆抗体和LRSC结合的山羊抗鼠IgG实现CHC22（红色）和AP3（绿色）的双重染色(天)和抗AP3δ亚单位抗血清，然后是FITC偶联的山羊抗兔IgG(E类). 每列代表使用不同过滤器查看的相同样本，CHC22与AP1、AP2或AP3的合并图像如所示(C类), (F类)和(我)分别是。
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图4。CHC22的免疫电镜定位。用pJM601CHC22转染的HeLa tet/on细胞诱导高水平CHC22表达24小时，然后透化、轻度固定并用针对CHC22（5nm金，小箭头）、AP1组分（10nm金，箭头）和网格蛋白轻链（15nm金，大箭头）的抗体标记。在包埋和切片之前，依次应用每个抗体并用蛋白A检测，蛋白A是附着在指示大小的金颗粒上的金，然后用多余的蛋白A封闭。选择的图像代表CHC22的细胞内分布（统计数据见正文），显示标记CHC22和AP1（γ亚基）的TGN中80–100 nm的小泡(A类)或标记CHC22和AP1（σ1亚单位），具有显著的蛋白质外壳(B类). (C类)类似的囊泡，其中一个囊泡专门标记为CHC22，另一个囊膜标记为CHC2、氯氰菊酯轻链和AP1。(天)外周小泡，主要标记为氯氰菊酯轻链，其中一个共同标记为CHC22。左边AP1（σ1亚单位）的标记表明这些被包裹的囊泡靠近内体。
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图5。细胞松弛素D治疗后CHC22与非肌肌球蛋白II的再分布。感染pLNCXCHC22以获得低水平CHC22增强表达的HeLa细胞，用（+）或不使用（-）1µg/ml细胞松弛素D处理20分钟，然后进行免疫荧光处理。细胞用抗CHC22单克隆抗体染色，然后用LRSC结合的山羊抗鼠IgG（红色）和抗非肌肉肌球蛋白II抗血清染色，最后用FITC-结合的山羊抗兔IgG染色（绿色）(A类). （A）中的每一列显示了使用不同过滤器查看的相同示例，并且合并的图像显示在底部面板中。请注意，在（A）的左侧面板中，一些细胞仅表达内源性CHC22水平，而用抗CHC22染色可以微弱地检测到这一水平（例如左上角和右下角的细胞）。感染pLNCXCHC22以获得低水平CHC22增强表达的HeLa细胞，用（+）或（-）1µg/ml细胞松弛素D处理20分钟，如上所述，还用LRSC结合的山羊抗鼠IgG检测到的抗CHC22单克隆抗体和抗氯氰菊酯轻链抗血清对其进行染色，用FITC-偶联山羊抗兔IgG检测(B类). 每列代表使用不同过滤器查看的相同样本，以检测红色（顶部）或绿色（底部）染色。
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图6。低温破坏CHC22 TGN定位。感染pLNCXCHC22以获得CHC22低水平增强表达的HeLa细胞要么未经治疗(A类–C类)或在20°C下培养1小时(天–F类)在进行洋地黄素清洗之前，去除胞浆，然后进行免疫荧光处理。用抗CHC22抗血清检测CHC22（红色），然后用LRSC结合的山羊抗兔IgG（A和D）检测。AP1（绿色）用MAb 100/3染色，然后用FITC-结合的山羊抗鼠IgG（B和E）染色。这些列表示使用不同过滤器查看的相同图像，底部面板是合并图像。
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图7。CHC22中心域的表达影响M6PR的细胞内分布。pJM601CHC22Hub转染的HeLa tet/on细胞(A类–F类)或使用pJM601CHC22(G公司–J型)诱导高水平CHC22Hub表达或高水平全长（FL）CHC22表达24小时。用抗CHC22单克隆抗体对细胞进行CHC22Hub（显示在A、C和E中）或CHC22FL（显示在G和I中）的表达染色，然后用LRSC结合的山羊抗鼠IgG染色。用阳离子非依赖性M6PR抗血清双重染色（A）、（C）和（G，其次是FITC-结合山羊抗兔IgG。水平行表示用不同滤镜观察的相同图像，以分别在左侧和右侧看到红色和绿色染色。注意，并不是转染培养物中的所有细胞都表达CHC22Hub或CHC22FL，这已通过抗T7 MAb染色证实，该抗体与转染蛋白上的表位标签反应（未显示）。非加压细胞作为M6PR或氯菊酯LC内源性染色的阴性对照，其染色模式与未转染或未诱导转染分子表达的对照细胞的染色模式相同。
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