Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells

doi:10.1523/JNEUROSCI.21-05-01538.2001

.2001年3月1日；21(5):1538-47.

doi:10.1523/JNEUROSCI.21-05-01538.2001。

内皮细胞诱导星形胶质细胞分化

H米¹, H海伯利, B A桶

附属公司

PMID： 11222644
预防性维修识别码： PMC6762957型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.21-05-01538.2001

内皮细胞诱导星形胶质细胞分化

H米等。神经科学. 2001.

.2001年3月1日；21(5):1538-47.

doi:10.1523/JNEUROSCI.21-05-01538.2001。

作者

H米¹, H海伯利, B A桶

附属

¹斯坦福大学医学院神经生物学系，美国加利福尼亚州斯坦福94305-5125。

PMID： 11222644
预防性维修识别码： PMC6762957型
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.21-05-01538.2001

摘要

在这里，我们研究了在发育中的大鼠视神经中控制星形胶质细胞分化的机制。星形胶质细胞通常由胚胎视神经内的星形胶质细胞前体细胞生成。我们发现内皮细胞和星形胶质细胞分化之间存在密切的时间和空间相关性。我们通过开发一种免疫筛选方法来从发育中的视神经中高度纯化内皮细胞，从而测试内皮细胞在诱导星形胶质细胞分化中的潜在作用。我们表明，纯化的内皮细胞，而不是其他胚胎视神经细胞类型，在体外强烈诱导纯化的星形胶质细胞前体细胞分化为星形胶质细胞。白血病抑制因子（LIF）和LIF受体先前在体内参与星形胶质细胞分化。我们发现纯化的内皮细胞表达LIF mRNA，并且其诱导星形胶质细胞分化的能力被中和的抗LIF抗血清阻止，而不是抗睫状神经营养因子抗血清。这些发现证明了内皮细胞在诱导星形胶质细胞分化中的作用。内皮细胞诱导星形胶质细胞分化在系统发育、解剖和功能上都有意义，因为星形胶质细胞与整个大脑的脑血管系统和鞘毛细血管同时进化。纯化和培养星形胶质细胞和内皮细胞的能力应为未来血脑屏障发育的研究提供一个良好的模型系统。

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数字

**图1。**
视神经发育中星形胶质细胞分化与血管形成的时间和空间相关性。E17发育中大鼠视神经的纵向冷冻切片(*A–C*)，E18(*D–F型*)，E19(*G–I型*)，E20(*J–L型*)和P1(*M–O型*)被GFAP抗血清染色(A类,D类,*G公司*,J型,*M（M）*)，是星形胶质细胞的特异性标记物。GFAP染色在E17处很少，但在E18处首次在神经表面附近检测到。染色强度随着年龄的增长而增加，更深入神经。P1染色延伸至整个神经。相同年龄段的视神经切片被两种内皮特异性标记物（VWF抗血清）加倍(B类,E类,*H（H）*,K,N个)和罗丹明结合的BSLI(C类,F类,我,*L（左）*,*O（运行）*). VWF和BSLI标记共定位，显示出与GFAP染色相似的时间进程和模式。比例尺，100μm

**图2。**
发育中的视神经GFAP染色。E18和E19视神经的纵向冷冻切片用抗GFAP抗体染色，并在比图1所示更高的放大倍数下观察。E18处的大多数GFAP染色位于神经表面附近，软脑膜正下方(箭头). 到E19时，软脑膜下的染色变得更加强烈，并开始深入神经。比例尺，50μm。

**图3。**
培养中纯化血管内皮细胞的形态和免疫反应。纯化血管内皮细胞的相控显微照片(A类)和软脑膜细胞(B类)无血清培养3d后。VEC趋向于纺锤形(A类)而软脑膜细胞则呈现扁平的片状外观(B类). 为了确认VEC的纯度，在用抗Tie2抗体分离后立即进行免疫染色(C类,D类). 所有纯化细胞，如图所示(C类)用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色，Tie2⁺(D类). 比例尺，100μm。

**图4。**
纯化的VECs和pial细胞对星形胶质细胞分化的影响。A类，如图所示，将纯化的APC培养在悬浮在纯化VEC或软脑膜细胞调节层上方的盖玻片上。单独培养的APC(*没有人*)或使用LIF(*LIF公司*)作为阴性和阳性对照。4天后，用GFAP抗血清标记APC培养物。从E17和P1视神经中纯化的VECs显著促进了星形细胞分化，但从任何年龄的神经中纯化的pial细胞都不能显著促进星形细胞分化。结果表示平均值±SD(n个= 3).B类，LIF中和抗体对VEC促进星形胶质细胞分化的影响。收集VEC条件培养基，并在4°C条件下孵育过夜(*VEC公司*)，中和LIF抗体(*VEC公司*α*LIF公司*)，中和CNTF抗体(*VEC公司*α*CNTF公司*)或中和LIF抗体加上过量LIF(*VEC公司*α*LIF LIF（后进先出）*). 纯化的APC在GFAP免疫染色前在这些条件培养基中培养4天。除非向培养基中添加过量的LIF，否则LIF中和抗体会显著降低VEC条件培养基诱导星形胶质细胞分化的能力。结果表示平均值±SD(n个= 3).

**图5。**
血管内皮细胞对星形胶质细胞分化的影响。纯化的APC单独培养(A类,B类)或悬浮在纯化VEC调节层之上(C类,D类)或软脑膜细胞(E类,F类). 4天后，用抗GFAP抗体对APC培养物进行染色(A类,C类,E类)以及DAPI核染色(B类,D类,F类). 除非与VEC培养，否则大多数APC保持未分化状态。比例尺，100μm。

**图6。**
LIF中和抗体对VEC诱导星形胶质细胞分化的影响。纯化的APC在经抗LIF抗体处理的VEC条件培养基中培养(A类,B类)，抗CNTF抗体(C类,D类)或抗LIF抗体加上过量LIF(E类,F类). 4天后，用抗GFAP抗血清对APC培养物进行染色(A类,C类,E类)和DAPI核染色(B类,D类,F类). 少数APC分化为GFAP⁺存在LIF中和抗体的星形胶质细胞。

**图7。**
视神经和视网膜LIF mRNA的RT-PCR分析。从E17视网膜、纯化的E17 APC以及从P1视神经分离的VEC和软脑膜细胞中提取总RNA。随后，使用LIF特异性引物对总RNA进行RT-PCR。以RT-PCR或不使用GAPDH引物进行反转录的PCR作为对照。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上分离，并用溴化乙锭进行可视化。

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