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.2001年2月15日；20(4):661-71.
doi:10.1093/emboj/204.661。

外源性细胞色素c可挽救凋亡中线粒体呼吸功能障碍的可逆成分

V K穆萨 1, M C Wei先生, K F黄油, L斯科拉诺, V Panoutsakopoulou先生, C A曼奈拉, S J Korsmeyer公司
附属公司

外源性细胞色素c可挽救凋亡中线粒体呼吸功能障碍的可逆成分

V K穆萨等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

多条凋亡途径从线粒体膜间间隙释放细胞色素c，导致下游半胱氨酸蛋白酶激活。体内激活Fas（CD95）导致线粒体外膜的通透性增加，细胞色素c储备耗尽。对耗氧量、NADH氧化还原状态和膜电位的连续测量显示呼吸状态转换丧失。tBID诱导的呼吸衰竭不需要任何半胱天冬酶活性。在早期，重新添加外源性细胞色素c可显著恢复呼吸功能。然而，随着时间的推移，线粒体显示出越来越多的不可逆呼吸功能障碍以及减少的钙缓冲。电子显微镜和断层重建显示，线粒体不对称，基质突出，内膜膨胀，嵴结构部分丢失。因此，除了下游半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活外，细胞色素c的凋亡性再分布还负责线粒体呼吸功能障碍的独特程序。

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数字

无
图1。细胞色素的外膜渗透性和损失c（c）Fas活化肝细胞线粒体中。(A类)野生型和非野生型肝线粒体线粒体颗粒（P）和上清液（S）组分的Western blot分析投标–/–小鼠注射生理盐水或抗Fas抗体后90分钟。为了比较完全释放，包括低血压裂解的控制线粒体。(B类)Colombini及其同事开发的线粒体外膜渗透性分析（Lee等人，1994年）。外源细胞色素c（c）如果细胞色素c（c）可以穿过外膜进入细胞色素c（c）氧化酶。低血压溶解的线粒体（有丝分裂体）外膜破裂，随着细胞色素的增加，耗氧量急剧增加c（c），证明了该分析的实用性。(C类)添加外源细胞色素后的耗氧量c（c）注射抗Fas抗体后30、60或90分钟从野生型小鼠肝脏分离的线粒体，以及来自投标–/–Fas处理后90分钟。
无
图2。线粒体氧化磷酸化和呼吸状态概述。缩写：UQ，泛醌；c、 细胞色素c（c）; IM，线粒体内膜；OM，线粒体外膜；Δψ米线粒体膜电位；VDAC，电压依赖性阴离子通道；KCN、氰化钾；V（V）氧气，耗氧量。
无
图3。Fas途径损伤的线粒体中NADH氧化还原转换丢失，类似于氰化物处理的线粒体(A类)在添加碳底物（5 mM谷氨酸+5 mM苹果酸）、ADP脉冲（100 nmol）和最终氰化物（KCN，1 mM）后，对注射盐水的野生型小鼠的线粒体进行NADH荧光监测。(B类)线粒体来自投标–/–注射抗Fas抗体90分钟后，肝脏对碳底物（谷氨酸+苹果酸）和ADP产生反应，类似于（A）中的野生型对照。(C类)为野生型小鼠的Fas活化线粒体提供碳底物（谷氨酸+苹果酸）和随后添加的两种ADP（100 nmol），并绘制NADH荧光图。(D类)对照野生型线粒体在时间0时与氰化物（1 mM）孵育。进行碳底物（谷氨酸+苹果酸）和两次随后的ADP（100 nmol）添加，并监测NADH荧光。
无
图4。外源性细胞色素拯救NADH呼吸转换c（c）最初用复合I碳底物（5 mM谷氨酸+5 mM苹果酸）培养新鲜分离的线粒体。在盐水注射后（A和D）或注射抗Fas抗体后60分钟（B和E）和90分钟（C和F）从小鼠体内获得肝线粒体。线粒体显示为不存在（A–C）或存在（D–F）10µM细胞色素c（c）. (A类)盐水处理小鼠的线粒体对添加的ADP（100 nmol）脉冲作出反应，经历典型的NADH呼吸转变。(B类)注射60分钟后，NADH氧化还原转变变缓，需要更长时间。(C类)治疗90分钟后，添加ADP没有反应，NADH水平也没有恢复。(D类)与（A）中的实验相同，只是它是在存在10µM细胞色素的情况下进行的c（c），表明盐处理的控制线粒体即使在细胞色素存在的情况下也继续进行NADH转换c（c）.细胞色素c（c）熄灭NADH荧光，因此年-axis在细胞色素存在下进行的实验中被重新标定c（c）（D–F）。(E类)添加细胞色素c（c）与（B）中的线粒体相比，加深状态3 NADH氧化还原瞬态并提高恢复。(F类)之前治疗90分钟后分离出的线粒体（E）没有经历NADH转换，但带有外源性细胞色素c（c），现在经历了强劲的氧化还原转变，表明呼吸链仍然可以被挽救。
无
图5。外源细胞色素部分修复Fas诱导的线粒体呼吸和膜电位缺陷c（c）将新分离的线粒体（注射盐水或抗Fas抗体后）放置在耗氧量（灰色）和TPP的呼吸室中+同时测量浓度（黑色）。(A类)控制线粒体对添加的碳底物（5 mM谷氨酸+5 mM苹果酸）产生膜电位。添加ADP（100 nmol）后，线粒体暂时去极化并经历一次耗氧爆发（状态3呼吸），直到添加的ADP转化为ATP。这些线粒体继续对添加的ADP作出反应，表明呼吸控制完好。(B类) 投标–/–注射抗Fas抗体90分钟后分离的肝线粒体也表现出对碳底物和ADP的高度呼吸控制和膜电位反应，与（A）中的正常野生型线粒体没有区别。(C类)注射抗Fas抗体60分钟后获得的线粒体对添加的碳底物（谷氨酸+苹果酸）表现出最小的反应性，但添加ADP后出现轻微的膜去极化。(D类)用10µM外源性细胞色素孵育Fas-pathway损伤的线粒体，如（C）所示c（c）时间为0。膜电位现在响应于碳基质以及ADP的两个脉冲。耗氧量对ADP脉冲也有反应，表明呼吸控制部分恢复。(E类)Fas活化90分钟后获得的线粒体显示膜电位，该电位不随谷氨酸+苹果酸的添加而增加。耗氧量和膜电位对ADP的增加没有反应，表明呼吸失去控制。(F类)用10µM外源性细胞色素孵育Fas-pathway损伤的线粒体，如（E）所示c（c）时间为0。膜电位现在随着谷氨酸+苹果酸的反应而增加，而膜电位则随着添加ADP后耗氧量的增加而降低，这表明通过添加细胞色素可以恢复呼吸控制c（c）在实验后期，在耗氧量减慢且膜电位适度恢复后，线粒体仍然能够对第二次ADP脉冲作出去极化反应。
无
图6。胱天蛋白酶抑制不能阻止tBID诱导的呼吸缺陷。从未经处理的野生型小鼠肝脏（MLM）分离的线粒体与320 pmol tBID/mg线粒体蛋白（黑线）或tBID加50µM zVAD-fmk（深灰色线）孵育，或在呼吸缓冲液中未经处理（浅灰色线）。用克拉克型电极测量耗氧量。通过添加200 pmol羰基氰化物开始解偶联呼吸米-氯苯腙（CCCP）/mg线粒体蛋白（株）。如有说明，20µmol NADH/mg线粒体蛋白和10µmol-细胞色素c（c）/添加mg线粒体蛋白。
无
图7。Fas损伤线粒体的电镜和层析重建(A类)抗Fas抗体治疗90分钟后，肝脏切片的代表性区域显示线粒体有大气泡（箭头）。(B类)带有气泡的线粒体半厚（0.22µM）切片的电子层析重建的横截面切片（6 nm厚）。(C类和D类)重建线粒体的两张表面渲染图，显示外膜破裂（红色），内表面膜破裂（IM），有大气泡（黄色）和选定嵴（绿色），IM空间有狭窄的管状连接（箭头）。
无
图8。线粒体肿胀和钙缓冲能力丧失。(A类)90度侧面散射提供了一种测量线粒体大小的方法，用于控制从盐水注射小鼠肝脏中纯化的线粒体。控制线粒体膨胀以响应钙脉冲（20 nmol CaCl2). (B类)钙引起膨胀的能力2+保存在线粒体中投标–/–注射抗Fas抗体后90分钟，小鼠分离。(C类)注射Fas抗体60分钟后，野生型肝线粒体对钙的添加表现出迟钝的肿胀反应。(D类)到90分钟时，线粒体开始肿胀，对钙的添加没有反应。(E类)用钙指示剂Cacium Green 5N荧光法测定线粒体外钙。控制线粒体可以缓冲多个脉冲（10 nmol CaCl2)添加钙（箭头）。(F类)Fas活化90分钟后分离的线粒体甚至不能缓冲钙的单一脉冲。
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