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.2000年12月；74(24):11566-73.
doi:10.1128/jvi.74.24.11566-11573.2000。

流感A病毒NS1蛋白阻止NF-kappaB的激活和α/β干扰素的诱导

X王 1, M李, H Zheng先生, T集合, P苍白, A乞求, 加西亚·萨斯特雷
附属公司

甲型流感病毒NS1蛋白阻止NF-κB的激活和α/β干扰素的诱导

X王等。 J维罗尔. 2000年12月.

摘要

α/β干扰素（IFN-alpha/beta）系统是抵抗病毒感染的第一道防线之一。因此，大多数病毒编码IFN拮抗因子，增强病毒在宿主体内的复制。我们之前已经证明，缺乏NS1基因的重组甲型流感病毒（delNS1）只能在IFN-α/β缺陷系统中有效复制。与这一观察结果一致，我们发现，组织培养细胞感染delNS1病毒，但未感染野生型流感A病毒，诱导了干扰素α/β基因（包括干扰素β）mRNA的高水平合成。众所周知，IFN-beta启动子的反式激活依赖于NF-kappaB和其他几个转录因子。有趣的是，与感染野生型病毒的细胞相比，感染德尔NS1病毒的细胞显示出高水平的NF-κB活化。在delNS1病毒感染期间，NF-kappaB通路的主要负性抑制剂的表达阻止了IFN-beta启动子的反式激活，证明了NF-kampaB激活与delNS1感染细胞中IFN-alpha/beta合成之间的功能联系。此外，NS1蛋白的表达阻止了病毒和/或双链RNA（dsRNA）介导的NF-kappaB通路和IFN-beta合成的激活。甲型流感病毒NS1蛋白的这种抑制特性取决于其结合dsRNA的能力，支持一种模型，即流感病毒感染期间产生的NS1与dsRNA的结合阻止了IFN系统的激活。因此，NS1介导的NF-kappaB通路抑制可能在a型流感病毒的发病机制中发挥关键作用。

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数字

图1
图1
MEF中delNS1病毒感染诱导IFN-α/β特异性mRNA。使用从模拟感染的MEF或感染PR8或delNS1病毒的MEF中分离的RNA，在指定的时间内，以MOI为1，对与IFN-α和IFN-β相对应的mRNA进行Northern blot分析。共使用10μg RNA。Northern blot检测来自管家基因（β-actin）的mRNA作为对照。
图2
图2
MEF中delNS1病毒感染激活NF-κB。（A） EMSA检测活化NF-κB。MEF在指定时间内未经治疗（UT）、模拟感染或感染PR8、delNS1或NDV病毒，MOI为1。用NF-κB特异性DNA探针对核提取物进行EMSA。TNF-α和dsRNA-处理的细胞作为阳性对照。（B） NF-κB复合物的超移位。用抗p65和抗p50抗体（Ab）在感染delNS1或NDV的MEF中转移NF-κB复合物，每次6小时。
图3
图3
NF-κB对delNS1病毒诱导的IFN-β基因表达至关重要。（A） 用pIFN-CAT（在小鼠IFN-β启动子下编码CAT报告基因）和表达超阻遏物形式IκB、IκB（SA）或空载体的质粒共同转染293个细胞的单层。转染后一天，用50μg dsRNA模拟处理或转染细胞，或以1的MOI感染PR8、delNS1或NDV病毒。一天后，用5μl细胞提取物进行CAT分析。（B） 图3A所示结果的定量分析。（C） 用pIFN-CAT和表达IκB激酶、IKKβ（KA）显性阴性形式或空载体的质粒共同转染293个细胞的单层。转染后一天，细胞按A组处理。显示定量结果。（D） 用表达IκB（SA）的质粒或空载体转染293细胞。转染后一天，细胞在指定的时间内以1的MOI感染PR8、delNS1或仙台病毒。提取RNA，并用IFN-β和β-肌动蛋白mRNA特异性探针进行Northern印迹分析。
图4
图4
NS1蛋白的dsRNA结合域足以阻止NF-κB活化和IFN-β诱导。（A） 在NF-κB应答启动子pκB-Luc的控制下，用含有报告基因的质粒转染293细胞。此外，用表达NS1、NS1（1-73）、NS1的质粒（1-73、R38A/K41A）或空载体共同转染细胞。转染后一天，细胞被转染10μg dsRNA或感染PR8、delNS1或仙台病毒，MOI为1。转染后两天，测定荧光素酶活性。在所有转染中，pRL-TK-Luc编码雷尼利亚荧光素酶在组成启动子的控制下被联合转染，并且雷尼利亚荧光素酶活性被用作内部控制，以使结果正常化。（B） 用pIFN-CAT和表达NS1、NS1（1-73）或NS1（1–73，R38A/K41A）蛋白或空载体的质粒共转染293个细胞。转染后一天，用10μg dsRNA转染细胞，或在MOI为1时感染PR8或delNS1病毒，或在DOI为10时感染仙台病毒。转染后两天，进行CAT检测，并对结果进行量化。（C） 用表达NS1或NS1（1–73）蛋白的质粒或空载体转染293细胞。转染后一天，细胞在指定的时间点以1的MOI感染delNS1或仙台病毒。提取RNA并使用干扰素-β和β-肌动蛋白mRNA特异探针进行Northern blot分析。
图4
图4
NS1蛋白的dsRNA结合域足以阻止NF-κB活化和IFN-β诱导。（A） 在NF-κB应答启动子pκB-Luc的控制下，用含有报告基因的质粒转染293细胞。此外，用表达NS1、NS1（1-73）、NS1的质粒（1-73、R38A/K41A）或空载体共同转染细胞。转染后一天，细胞被转染10μg dsRNA或感染PR8、delNS1或仙台病毒，MOI为1。转染后两天，测定荧光素酶活性。在所有转染中，pRL-TK-Luc编码雷尼利亚荧光素酶在组成启动子的控制下被联合转染，并且雷尼利亚荧光素酶活性被用作内部控制，以使结果正常化。（B） 用pIFN-CAT和表达NS1、NS1（1-73）或NS1（1–73，R38A/K41A）蛋白或空载体的质粒共转染293个细胞。转染后一天，用10μg dsRNA转染细胞，或在MOI为1时感染PR8或delNS1病毒，或在DOI为10时感染仙台病毒。转染后两天，进行CAT检测，并对结果进行量化。（C） 用表达NS1或NS1（1–73）蛋白的质粒或空载体转染293细胞。转染后一天，细胞在指定的时间点以1的MOI感染delNS1或仙台病毒。提取RNA并使用干扰素-β和β-肌动蛋白mRNA特异探针进行Northern blot分析。
图4
图4
NS1蛋白的dsRNA结合域足以阻止NF-κB活化和IFN-β诱导。（A） 在NF-κB应答启动子pκB-Luc的控制下，用含有报告基因的质粒转染293细胞。此外，用表达NS1、NS1（1-73）、NS1的质粒（1-73、R38A/K41A）或空载体共同转染细胞。转染后一天，用10μg dsRNA转染细胞，或用MOI为1的PR8、delNS1或仙台病毒感染细胞。转染后两天，测定荧光素酶活性。在所有转染中，pRL-TK-Luc编码雷尼利亚荧光素酶在组成启动子的控制下被联合转染，并且雷尼利亚荧光素酶活性被用作内部控制，以使结果正常化。（B） 用pIFN-CAT和表达NS1、NS1（1-73）或NS1（1–73，R38A/K41A）蛋白或空载体的质粒共转染293个细胞。转染后一天，用10μg dsRNA转染细胞，或在MOI为1时感染PR8或delNS1病毒，或在DOI为10时感染仙台病毒。转染后两天，进行CAT测定，并对结果进行量化。（C） 用表达NS1或NS1（1–73）蛋白的质粒或空载体转染293细胞。转染后一天，细胞在指定的时间点以1的MOI感染delNS1或仙台病毒。提取RNA并使用干扰素-β和β-肌动蛋白mRNA特异探针进行Northern blot分析。
图5
图5
NS1（1–126）病毒感染可阻止NF-κB的激活和IFN-β的诱导。（A） MDCK细胞以1的MOI感染PR8或NS1（1-126）病毒。每次6小时，提取细胞提取物。用抗NS1抗体对细胞提取物（10μl）进行Western分析。wt，野生型。（B） 293个细胞被模拟感染或感染了delNS1、PR8或NS1（1-126）病毒，MOI为1。每次6小时，制备核提取物，并用活化NF-κB特异性探针进行EMSA。（C） 293个细胞感染了NS1（1-126）或delNS1病毒。在指定的时间提取RNA，并使用IFN-β和β-actin mRNA特异探针进行Northern blot分析。
图6
图6
甲型流感病毒NS1蛋白抑制干扰素-β诱导机制的模型。流感病毒感染导致产生dsRNA，dsRNA反过来激活转录因子AP-1（ATF2/c-JUN）、IRFs（IRF-3/7）和NF-κB。这些转录因子与干扰素-β启动子结合后相互协作，促进RNA聚合酶II机制的募集（增强子形成），并刺激干扰素βmRNA的合成。流感病毒感染期间NS1蛋白的表达可阻止dsRNA介导的IRF-3的激活（54）和NF-κB（本研究），从而抑制IFN-β的生成。这种抑制作用取决于NS1结合dsRNA的能力。因此，在A型流感病毒感染期间，NS1蛋白也可能阻止ATF2/c-JUN的激活。此外，应该注意到，PKR是一种dsRNA-激活的激酶，在不同的IFN途径中起着重要作用，既是IFN合成的诱导剂，也是翻译的抑制剂，其水平随着IFN和IRF-1的激活而转录增加（43，61），还发现在甲型流感病毒感染期间被NS1蛋白抑制（4，27）。NS1蛋白对IRF和NF-κB激活的抑制很可能涉及对PKR和/或dsRNA激活的非特征化上游激酶的抑制。
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