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.2000年11月15日；19(22):6185-95.
doi:10.1093/emboj/19.22.6185。

特定PML亚型对核小体中p53活性的调节

V Fogal公司 1, M戈斯蒂萨, P桑迪, P扎基, T斯特恩斯多夫, K延森, P P潘多尔菲, H威尔, C施耐德, G Del Sal公司
附属公司

特定PML亚型对核小体中p53活性的调节

V Fogal公司等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

SUMO-1对早幼粒细胞白血病蛋白（PML）的共价修饰是核体（NB）组装的先决条件，核体是在各种人类疾病中被破坏的亚核结构，与转录和生长控制有关。在这里，我们证明p53通过一种特定的PML亚型（PML3）或SUMO-1和hUbc9的共表达被招募到NBs中。NB靶向依赖于p53通过其核心结构域与PML3的C末端区域的直接关联。p53在NBs中的重新定位以启动子特异性的方式增强了p53的反式激活，并影响细胞存活。我们的结果表明，PML和p53依赖性生长抑制途径之间存在相互干扰，这意味着NB及其驻留蛋白作为p53功能的调节剂发挥着重要作用。

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数字

无
图1。p53重新调整为NB。(A类)将10 ng/µl pcDNA3p53wt（b–d）、pRcCMVp53K386R（f–h）或pNLS-βgal（i–k）与30 ng/µl pGFPSUMO-1和50 ng/µ尔pcDNA3HAhUbc9一起微量注射给SaOS-2细胞。用兔抗血清分析p53染色，用抗β-半乳糖苷酶单克隆抗体检测βgal-NLS的定位。一级抗体和GFP–SUMO-1染色分别通过与TRITC结合的二级抗体孵育或通过GFP的固有绿色荧光显示。两种颜色的融合产生黄色信号，对应于共定位蛋白质。（a和e）在没有共表达GFP–SUMO-1和HA-hUbc9的情况下，分别对p53 wt和K386R进行染色。(B类)用微量注射10 ng/µl pcDNA3p53wt和30 ng/¦µl pcDNA3PML3的SaOS-2细胞（a–c）进行上述p53表达分析，并使用抗PML单克隆抗体PG-M3进行PML染色，然后与FITC-结合二级抗体孵育。将pcDNA3PML3微量注射于U2OS细胞（d–f），如上所述检测内源性p53和过度表达PML3的定位。(C类)用紫外线和砷处理LOVO细胞2哦三用DO-1和1801单克隆抗体的混合物检测内源性p53的表达，然后用TRITC结合的二级抗体（a和c）孵育。用对PML3和FITC缀合的第二抗体特异性的兔多克隆血清显示内源性PML3染色（b和c）。
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图1。p53重新调整为NB。(A类)将10 ng/µl pcDNA3p53wt（b–d）、pRcCMVp53K386R（f–h）或pNLS-βgal（i–k）与30 ng/µl pGFPSUMO-1和50 ng/µ尔pcDNA3HAhUbc9一起微量注射给SaOS-2细胞。用兔抗血清分析p53染色，用抗β-半乳糖苷酶单克隆抗体检测βgal-NLS的定位。一级抗体和GFP–SUMO-1染色分别通过与TRITC结合的二级抗体孵育或通过GFP的固有绿色荧光显示。两种颜色的融合产生黄色信号，对应于共定位蛋白质。（a和e）在没有共表达GFP–SUMO-1和HA-hUbc9的情况下，分别对p53 wt和K386R进行染色。(B类)用微量注射10 ng/µl pcDNA3p53wt和30 ng/¦µl pcDNA3PML3的SaOS-2细胞（a–c）进行上述p53表达分析，并使用抗PML单克隆抗体PG-M3进行PML染色，然后与FITC-结合二级抗体孵育。将pcDNA3PML3微量注射于U2OS细胞（d–f），如上所述检测内源性p53和过度表达PML3的定位。(C类)用紫外线和砷处理LOVO细胞2哦三用DO-1和1801单克隆抗体的混合物检测内源性p53的表达，然后用TRITC结合的二级抗体（a和c）孵育。用PML3和FITC-结合二级抗体（b和c）特异的兔多克隆血清显示内源性PML3染色。
无
图2。PML3和p53核心结构域之间的直接相互作用介导了p53向NBs的重定位。(A类)各种p53缺失突变体的示意图，以及它们结合PML3和重新定位为NB的能力的总结。显示了反激活（Tr）、聚脯氨酸（PP）、DNA-结合（DBD）和四聚和非特异性DNA-绑定（Tm/NSDB）结构域。数字是指氨基酸。NA，未评估。(B类)向SaOS-2细胞微量注射10 ng/µl表达载体，单独编码各种p53缺失（a、e、i和m），或与pcDNA3PML3（30 ng/¦Μl）一起编码多种p53缺失，并分析p53和PML3染色，如图1B所示。(C类)按指示转染SaOS-2细胞，并用抗PML抗体（PG-M3）免疫沉淀。用抗p53抗体DO-1（1-6道）或抗HA抗体进行免疫印迹，以检测HA标记的p53 294-393蛋白（7道和8道）。下面的面板显示了各种过度表达蛋白的表达水平。
无
图3。p53向NBs的募集取决于其与特定PML同种型的相互作用。(A类)如图1B所示，通过免疫荧光分析微量注射p53 wt（10 ng/µl）和30 ng/¦Μl PML–RARα（a–c）或PML-l（d–f）的SaOS-2细胞。(B类)各种PML蛋白的示意图，显示其功能域。上限是指PML特异性氨基酸，下限是指RARα中的残基。图中显示了苏木遗址（S）。(C类)用抗PML多克隆抗体对转染PML3、PML-L或PML-RARα并沉淀GST-p53或GST的SaOS-2细胞的裂解物进行免疫印迹分析。(D类)使用执行的下拉实验在体外如图所示，翻译的p53 wt或不同的缺失，以及GST–PML3Ct或GST。复合物通过SDS-PAGE溶解，并通过放射自显影进行可视化。
无
图4。PML3以p53依赖的方式影响细胞存活。(A类)将所示质粒（30 ng/µl）与pGFP（15 ng/¦Μl）作为标记物，微量注射U2OS（左侧）和MG63（右侧）细胞。20小时后，细胞存活率以GFP阳性恢复细胞的百分比进行评分。(B类)在单独（bars 2、3和5）或组合（bars 4和6）异位表达p53 1–355（20 ng/µl）、PML3（30 ng/¦Μl）和PML-l（30 ng/l）后，对MG63细胞进行细胞存活分析。用PLAP作为阴性对照，调整所有样本的总DNA量。图表示至少七个独立实验的平均值。
无
图5。PML3以启动子特异的方式增强p53转录活性。p53 wt的反激活(A类)和p53 1–355(B类)通过将pcDNA3p53wt或pcDNA3p53 1–355单独或与PML3或PML-L一起转染MG63细胞，对p21-LUC或PIG3-LUC报告子进行检测，如图所示。在每个病例中共同转染肾素荧光素酶报告子（pRL-CMV；50 ng），以使转染效率正常化。图表示至少四个独立实验的平均值。用DO-1抗体进行western blotting分析每种裂解物的等分样品，以证明所有样品中p53的表达水平具有可比性（下表）。
无
图6。p53与PML3存在时的核基质分数相关。在NP-40存在下，通过高盐缓冲液裂解将来自如所述转染的MG63细胞的核提取物分离为可溶性（S）和不溶性（I）级分。用SDS-PAGE分离每个组分的可比数量的蛋白质，并用抗p53 DO-1抗体或抗PML多克隆血清进行免疫印迹。转染效率通过加载每种样品核分馏前获得的总裂解物（T）的等分来控制。
无
图7。PML3的突变和向NB中招募p53对于增强p53转录活性是必要的。(A类)PML公司–/–用10纳克/µl p53 wt或1–355与30纳克/µl PML3S一起微量注射MEFs–并对p53和PML3染色进行分析，如图1B所示。(B类)转染PML3S的SaOS-2细胞裂解物–如图所示，用抗PML多克隆抗体进行免疫印迹分析，并用GST–p53或GST沉淀。(C类)PML中荧光素酶活性测定–/–单独或与PML3或PML3S一起转染PIG3-LUC报告子和pcDNA3p53 1–355的MEF–，如图所示。在每个病例中，共转染pRL-CMV（50 ng）以使转染效率正常化。该图表示至少三个独立实验的平均值。用DO-1和抗PML抗体进行western blotting分析每一份裂解物的等分样品，以监测转染效率（下面板）。
无
图8。PML3介导的p53向NB募集的模型以及与其他NB驻留因子的假定相互作用。SUMO-1（S）在PML3上的结合通过PML与各种蛋白质（如p53、p300/CBP和hDaxx）之间的直接相互作用或通过未知机制重新定位其他元素（Sp100），导致NB的组装。NB中的蛋白质-蛋白质相互作用以及翻译后修饰可能调节特定的生物功能。
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