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.2000年11月13日；151(4):931-44.
doi:10.1083/jcb.151.4.931。

连接蛋白43缺乏导致延迟骨化、颅面畸形和成骨细胞功能障碍

F勒坎达 1, P M Warlow公司, 沙伊赫, F富兰, T H斯坦伯格, R Civitelli公司
附属公司

连接蛋白43缺乏导致延迟骨化、颅面畸形和成骨细胞功能障碍

F勒坎达等。 J细胞生物学. .

摘要

连接蛋白（Cx）43是存在于成骨细胞中的主要缝隙连接蛋白。我们已经证明，表达内源性Cx43的成骨细胞中Cx45的过度表达导致细胞间通讯减少（Koval，M.，S.T.Geist，E.M.Westphale，A.E.Kemendy，R.Civitelli，E.C.Beyer和T.H.Steinberg，1995）。《细胞生物学杂志》。130:987-995）和几种成骨细胞分化标记物的转录下调（Lecanda，F.，D.A.Towler，K.Ziambaras，S.-L.Cheng，M.Koval，T.H.Steinberg和R.Civitelli，1998。分子生物学。手机：9:2249-2258）。在这里，使用Cx43缺失小鼠模型，我们确定了Cx43基因缺陷是否影响体内骨骼发育。在突变胚胎中，颅穹隆的膜内和软骨内骨化均延迟，来自迁移神经嵴细胞的颅骨也发育不良，出生时留下开放的孔。Cx43缺陷动物的锁骨、肋骨、脊椎和四肢也表现出延迟骨化，这表明骨骼异常并不局限于神经嵴缺陷。然而，Cx43基因缺失动物的轴向和阑尾骨骼在出生时基本正常。与野生型细胞相比，钙黄绿素在Cx43缺乏的成骨细胞中的细胞间扩散较差，其分化表型和矿化潜能受到严重损害。因此，除了报告的神经嵴细胞缺陷外，缺乏Cx43还导致广泛的成骨细胞功能障碍，导致矿化延迟和颅骨异常。由Cx43缝隙连接介导的细胞间信号传导对正常的成骨、颅面发育和成骨功能至关重要。

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数字

图1
图1
Cx43颅骨发育−/−胚胎。（a和b）茜素红/阿尔西安蓝染色E16.5野生型（WT）和Cx43颅骨侧视图−/−胚胎。（c和d）茜素红染色E18.5（c、e和g）野生型和（d、f和h）Cx43颅骨的背视图、（e和f）腹视图和（g和h）侧视图−/−胚胎。（g和h）E18.5处头骨的侧视图显示，Cx43缺失小鼠的顶骨、鼻骨、额骨和颞骨鳞状部分的早期矿化，尽管所有这些元素在发育过程中仍处于低矿化状态，尤其是在其喙部边界周围。F、 额骨；P、 顶骨；S、 颞骨鳞状部分；一、 顶骨；E、 枕骨；M、 下颌骨；T、 鼓室环；PL，腭骨；PT，翼骨；BS，基蝶骨；AS，泽泻骨；和BO，枕底骨。
图2
图2
Cx43下颌骨发育−/−小鼠。（a和b）E18.5和（c和d）野生型（WT）和Cx43出生时下颌骨的茜素红/阿尔西安蓝染色−/−室友。在新生儿突变体中，下颌骨较小，牙槽嵴更圆，牙弓更平。这种畸形导致突变动物的鼻子稍小且更尖。在一些Cx43基因缺失的新生小鼠中，出生时（d）颞骨软骨原基和下颌骨髁突区仍然存在。注意，（b，箭头）Cx43在E18.5处缺少切牙−/−胚胎和（d）出生时较不突出的牙齿。此外，请注意突变动物的牙槽嵴（AR）和软骨冠状突（CP）不太明显。
图3
图3
Cx43颅骨发育−/−出生时。（a和b）（a和c）野生型和（b和d）Cx43出生时颅顶的侧视图和（c和d）背视图−/−出生时的室友。注意，在纯合突变体中，枕骨的软骨原基突出，而顶骨、顶骨间骨和枕上骨较薄且发育较差，可以直接看到颅底。出生时（e）野生型和（f）Cx43基因缺失的同卵双胞胎颅底的腹视图。腭骨的水平层稍小，aliphenoid畸形，留下较大的未矿化区域，由腭骨、aliphenoid和颞骨界定。腭骨的水平部分和上颌骨的腭突，统称为腭架。鼓膜环缩小、变薄。颧弓的颈静脉骨较短，导致颧弓畸形。总的来说，鼻骨和上颌骨稍小，导致Cx43缺失动物的鼻子更尖、更小。J、 颧骨颈侧；F、 额骨；P、 顶骨；S、 颞骨鳞状部分；一、 顶骨；E、 枕外骨；M、 下颌骨；T、 鼓膜环；PL，腭骨；PT，翼骨；BS，基蝶骨；AS，泽泻骨；和BO，枕底骨。
图4
图4
（a和c）野生型和（b和d）Cx43的（a和b）顶骨和（c和d）枕骨的矢状截面−/−小鼠被藏红/坚牢绿色染色。注意，在Cx43纯合突变体中，顶骨更薄更脆。（d） 枕骨软骨原基在Cx43中更为突出−/−动物。
图5
图5
Cx43中的轴向发展−/−胚胎。（a和b）E15.5和（c）E16.5（a和d）野生型胚胎和（b、c和e）Cx43的茜素红/阿尔西安蓝染色胸椎侧视图−/−纯合突变体。（b和c）注意突变动物的脊椎和肋骨骨化延迟，肋骨变薄变形。茜素红染色的头部和胸部后视图（d）野生型和（e）Cx43−/−胚胎在E18.5显示出脊椎、四肢和枕外骨的类似骨化，但顶骨、顶骨间骨和枕上骨的骨化延迟。注意枕上骨的两个骨化中心在Cx43中没有融合−/−.
图6
图6
Cx43阑尾骨骼的发育−/−胚胎。（a）E14.5、（b）出生时锁骨和（c和d）出生时前肢用茜素红/阿尔西安蓝染色。注意，（a）E14.5突变胚胎中肩胛骨和长肢骨（肱骨、桡骨和肘骨）的矿化延迟，与（c和d）正常出生相比。此外，请注意锁骨缺乏膜内和软骨内骨化，仅在（a，箭头）Cx43中表现为小软骨模板−/−E14.5处的动物。然而，锁骨在出生时表现正常。（e） 野生型和Cx43藏红O/固绿染色股骨纵切面−/−新生儿。生长板的大小和形态明显正常，纯合子突变骨中的原发性海绵体也是如此。
图7
图7
野生型、杂合型Cx43颅骨成骨细胞中Cx的表达和细胞偶联+/−和纯合Cx43−/−出生时的小鼠。（a） 使用抗Cx45和Cx43抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹。Tubulin用于控制每条通道中的蛋白质负荷。（b） 钙黄绿素在不同基因型组颅骨成骨细胞之间的扩散。在将负载钙黄绿素的供体细胞“空降”到未标记的单层上两小时后，通过在每个细胞制备中的20个显微镜视野中计数已经接受荧光染料的相邻细胞，来评估染料偶联。加载钙黄绿素后，将同一基因型组的细胞作为供体细胞。（c） 每个基因型组的染料偶联定量。从单个预加载的供体细胞中提取钙黄绿素的细胞数量被计数作为染料偶联的测量。数据表示13-mm盖玻片中八个随机显微场的平均±SD（每个分离物十个盖玻片，每个基因型组四个细胞分离物的汇总数据）*P（P）<0.05，Mann-Whitney U检验。
图8
图8
来自新生动物颅骨或长骨（股骨和胫骨）的成骨细胞产生骨基质蛋白。（a） 从野生型杂合Cx43培养物中分离出总RNA+/−和纯合Cx43−/−细胞，如图所示。通过半定量RT-PCR评估I型胶原（胶原蛋白-I）、骨桥蛋白、骨钙素和磷酸甘油醛脱氢酶的稳态mRNA水平。（b） 使用颅骨细胞对三个基因型组的I型胶原（胶原蛋白-I）、骨桥蛋白和微管蛋白进行Western分析。
图8
图8
来自新生动物颅骨或长骨（股骨和胫骨）的成骨细胞产生骨基质蛋白。（a） 从野生型杂合Cx43培养物中分离出总RNA+/−和纯合Cx43−/−细胞，如图所示。通过半定量RT-PCR评估I型胶原（胶原蛋白-I）、骨桥蛋白、骨钙素和磷酸甘油醛脱氢酶的稳态mRNA水平。（b） 使用颅骨细胞对三个基因型组的I型胶原（胶原蛋白-I）、骨桥蛋白和微管蛋白进行Western分析。
图9
图9
颅骨成骨细胞的体外矿物沉积。从新生儿野生型（WT）颅盖骨分离的细胞，杂合Cx43+/−和纯合Cx43−/−小鼠在含有β-甘油磷酸和抗坏血酸的矿化培养基中生长三周。（a） 培养物用Von Kossa染色。（b） 沉积在细胞外基质中的矿物质的范围被量化为表面积（单位：cm2)每个井内覆盖黑色污渍（9.6厘米2)使用计算机图像分析仪。图示和条形图代表了在每个基因型组的四个独立细胞分离物中进行的相同实验。
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