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。2000年9月26日；97(20):10832-7.
doi:10.1073/pnas.170276797。

通过与Hsp90结合调节Akt激酶活性

S佐藤 1, N富士达, T Tsuruo先生
附属公司

通过与Hsp90结合调节Akt激酶活性

S佐藤等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

丝氨酸/苏氨酸激酶Akt/PKB是磷脂酰肌醇3-激酶的下游效应分子，被认为可以介导许多抗凋亡反应的生物作用。我们发现Akt在体内与90kDa的热休克蛋白（Hsp90）形成复合物。通过构建缺失突变体，我们确定Akt的氨基酸残基229-309与Hsp90结合，Hsp90beta的氨基酸残基327-340与Akt结合。抑制Akt-Hsp90结合导致Akt去磷酸化和失活，从而增加细胞对凋亡诱导刺激的敏感性。Akt的脱磷酸化是由蛋白磷酸酶2A（PP2A）介导的脱磷酸作用增加引起的，而不是由3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1介导的磷酸化减少引起的。这些结果表明，Hsp90通过阻止PP2A介导的去磷酸化，在维持Akt激酶活性方面发挥着重要作用。

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数字

图1
图1
Akt与Hsp90的结合体内. (A类)BALB/3T3和293T细胞裂解物与蛋白G孵育琼脂糖与对照羊IgG或羊抗Akt pAb结合。(B类)293T细胞转染模拟或标记有FLAG的WT-阿克特.细胞裂解物与抗FLAG M2琼脂糖。(C类)293T细胞与V5标记的WT联合转染-hsp90β和指示FLAG标记质粒。细胞裂解物与反FLAG M2琼脂糖。免疫沉淀蛋白是用所示抗体进行免疫印迹。分子大小标记是表示（kDa）。
图2
图2
野生型Akt和Akt缺失突变体与热休克蛋白90β。(A类)Akt和Akt缺失的结构域这些实验中使用的突变体用黑色条表示。这个参与强和弱Hsp90β的预测位点与Akt的绑定如示意图所示（阴影和虚线，分别）。(B–-D类)Mock或theV5标签WT-热休克蛋白90β被瞬时转染到293T电池以及模拟或指示的FLAG标签阿克特突变体。FLAG标记的蛋白质是用所示抗体进行免疫沉淀和免疫印迹。显示了分子大小标记（以kDa为单位）。
图3
图3
确定与Akt结合的Hsp90β结构域。(A类)Hsp90β和Hsp90？缺失的结构域这些实验中使用的突变体用黑色条表示。这个Hsp90β中预测的Akt结合位点如图所示（阴影）。(B类和C类)（他的）6-标记WT鼠阿克特只是暂时的转染293T细胞与模拟或指示标记了FLAGhsp90β突变体。这个（他的）6-标记蛋白被免疫沉淀用所示抗体进行免疫印迹。细胞裂解物也用抗FLAG M2单克隆抗体进行免疫印迹。分子大小标记是表示（kDa）。(D类)氨基酸的校准人类Hsp90β与人类等效区域的序列热休克蛋白90α。相同的残留物用黑色上的白色字母表示背景。人类Hsp90β和人类的GenBank登录号Hsp90α分别为M16660和X15183。(E类)V5标签WT-hsp90α或WT-hsp90β是与mock或指示标记了FLAG阿克特突变体。FLAG标记蛋白质被免疫沉淀和免疫印迹抗体。细胞裂解物也用抗V5抗体进行免疫印迹单克隆抗体。显示了分子大小标记（以kDa为单位）。
图4
图4
Hsp90分离后Akt的去磷酸化和失活。(A类)293T细胞转染FLAG标记重量-阿克特转染24小时后，细胞在不含血清（−）或10%FBS（+）的培养基中培养24小时后，FLAG标记的Akt被免疫沉淀用所示抗体进行免疫印迹。(B类)HA-标记阿克特突变体，V5标签重量-hsp90β和/或标记了FLAG的重量-阿克特共转染293T细胞。细胞24小时无血清，然后FLAG-标记的WT-Akt用所示抗体进行免疫沉淀和免疫印迹。这个用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。(C类)293T细胞转染模拟或标记有FLAG的WT-阿克特与mock或HA-tagged一起使用1–309阿克特.细胞缺血清24小时然后收割。细胞裂解物与蛋白G孵育琼脂糖与对照IgG（通道1）或抗Akt pAb结合（车道2和3）。免疫沉淀Akt的Akt激酶活性是估计的，如中所述材料和方法。垂直条代表三次测定的SD值。这个免疫沉淀蛋白和细胞裂解物进行免疫印迹带有指示的抗体。(D类)HT1080细胞转染FLAG标记的WT-阿克特与一起V5标签WT-hsp90β细胞被血清饥饿24小时，然后在37°C或45°C下培养20分钟实验中，用50μM LY294002处理细胞10分钟后热休克。免疫沉淀蛋白的Akt激酶活性如中所述，估计标记有FLAG的Akt材料和方法.垂直条代表一式三份的SD值决定。细胞裂解物也被免疫印迹显示抗体。(E类)转染HT1080细胞带有FLAG标记的WT-阿克特和V5标签重量-hsp90β与mock或HA-taged 1–309一起使用阿克特.将细胞无血清培养24小时，然后在37°C（−）或45°C（+）下培养20分钟免疫沉淀FLAG标记的WT-Akt和细胞裂解物用所示抗体进行免疫印迹。的表达式HA标记的1-309 Akt通过免疫印迹分析得到证实抗HA单克隆抗体（数据未显示）。指示分子大小标记（单位：kDa）。
图5
图5
通过抑制Akt-Hsp90结合诱导凋亡。(A类)293T细胞转染模拟或标记为1–309的FLAG阿克特.转染24天后h、 转染细胞在无血清中培养24小时培养基或含有10%FBS的培养基用DAPI染色，如材料和方法. (B类)293T细胞被视为中描述的A类.活动的增加caspase-3样蛋白酶（DEVDase活性）测定如下中描述的材料和方法.垂直钢筋表示三次测定的SD值。(C类)用模拟或FLAG标记的1–309转染293T细胞阿克特.转染24小时后，培养基为更换为无血清培养基车辆（1号和4号车道），30VP-16（通道2和5）的μg/ml，或VP-16的30μg/ml加上100μg/ml的Z-Asp-CH2-DCB（车道3和6）。细胞进一步培养24小时，然后收获。细胞用所示抗体对裂解产物进行免疫印迹。这个通过免疫印迹证实FLAG标记的1–309 Akt的表达用抗FLAG M2单克隆抗体进行分析（数据未显示）。(D类)293T细胞转染模拟或指示的FLAG标记质粒。转染24小时后，更换培养基使用含有30μg/ml VP-16的无血清培养基。细胞进一步孵育24小时。将细胞裂解物用所示抗体进行免疫印迹。分子大小标记是表示（kDa）。
图6
图6
Akt与Hsp90β的结合不会促进PDK1介导的Akt磷酸化。(A类)（他的）6-带标签的人PDK1系列或WT-尿液阿克特被转染与标记为1–635的FLAG一起注入293T细胞hsp90β（）或534–724hsp90β（ΔN）。免疫沉淀（His）6-标记蛋白和用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。(B类)293T细胞转染模拟或标记有FLAG的WT-或1–309阿克特。这些细胞是将血清饥饿24小时，然后培养细胞裂解物蛋白G琼脂糖与对照IgG（对照）或抗PDK1抗体（PDK1）。PDK1激酶活性估计如下中描述的材料和方法.垂直钢筋表示三次测定的SD值。The amount of the免疫沉淀PDK1蛋白通过Western抗PDK1单克隆抗体的印迹分析。转染细胞的表达FLAG标记的WT-或1–309 Akt通过免疫印迹分析得到确认抗FLAG M2单克隆抗体（数据未显示）。(C类)Mock或标记为1–309的FLAG阿克特转染293T细胞与HA-tagged WT一起-阿克特。细胞是将血清饥饿24小时，然后用含有10%FBS和500 nM冈田酸的培养基。在指定的时间点、细胞采集和细胞裂解物用所示抗体进行免疫印迹。(D类)标记有FLAG的WT-阿克特和V5标签重量-hsp90β共转染293T细胞。这个细胞需要血清24小时，然后在37°C或45°C持续20分钟。FLAG标记的WT-Akt被免疫沉淀孵化的在体外具有指定的活性量存在（+）或不存在（−）脂质小泡的人PDK1含PtdIns（3,4,5）P三在30°C下保持30分钟对反应进行电泳和免疫印迹，显示抗体。转染WT-Akt和Hsp90β的表达用抗FLAG M2单克隆抗体对细胞裂解物进行免疫印迹证实和抗V5单克隆抗体（数据未显示）。分子大小标记以kDa表示。
图7
图7
抑制Akt-Hsp90β复合物的形成促进PP2A介导的Akt去磷酸化。(A类)标记了FLAG的重量-阿克特与模拟或HA-taged 1–309阿克特.转染后24 h，用0、10或50μM LY294002处理细胞10最小值(B类)Mock或HA标记1–309阿克特与FLAG标记的基因一起转染293T细胞重量-阿克特.转染24小时后，培养基为在有（+）或无（−）500 nM冈田酸。(A类和B类)在指示的时间点，FLAG标记的WT Akt被免疫沉淀并用所示抗体进行免疫印迹。细胞裂解物是也用抗HA单克隆抗体进行免疫印迹。(C类)Mock或theHA-标签1–309阿克特转染293T细胞与V5标签WT一起-hsp90β和标记了FLAG的重量-阿克特.FLAG标记的WT-Akt被免疫沉淀并孵化在体外所示数量为存在（+）或不存在（−）1μM的纯化人PP2A冈田酸在30°C下放置30分钟。电泳反应并用所示抗体进行免疫印迹。分子尺寸标记以kDa表示。
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