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.2000年9月；11(9):3137-53.
doi:10.1091/mbc.11.9.3137。

Syntaxin 7定位于晚期内体区室，与Vamp 8结合，是晚期内体-溶酶体融合所必需的

B M马洛克 1, C W史密斯, G伊尔克, N A明亮, M林赛, E J帕金森, D A布鲁克斯, R G Parton公司, D E詹姆斯, J P Luzio公司, R C Piper公司
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Syntaxin 7定位于晚期内体室，与Vamp 8结合，是晚期内体-溶酶体融合所必需的

B M马洛克等。 分子生物学细胞. 2000年9月.
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摘要

来自细胞表面或转高尔基体网络的蛋白质通过一系列内体室到达溶酶体。内吞途径的最后一步是晚期内体与溶酶体的融合。该过程已在体外重建，并已证明需要NSF、α和γSNAP以及基于Rab GDI抑制的Rab GTPase。在酿酒酵母中，与溶酶体样液泡的融合事件由位于液泡膜上的结合蛋白Vam3p介导。为了确定控制溶酶体融合事件的分子机制，我们搜索了Vam3p的哺乳动物同源物。其中一个候选基因是syntaxin7。在这里，我们发现合成蛋白7集中在晚期内体和溶酶体中。免疫共沉淀实验表明，syntaxin 7与内胚体v-SNARE Vamp 8相关，后者与syntaxin7部分共定位。重要的是，我们证明了syntaxin 7是晚期内体与溶酶体在体外融合所需的特异性蛋白，从而形成杂交细胞器。总之，这些数据确定了在动物细胞的晚期内吞系统中起作用的SNARE复合体。

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数字

图1
图1
Syn7的表达。（A） 总膜分数由大鼠大脑（B）、肝脏（L）、肾脏（K）、脾脏（S）、睾丸制成（T） 和MDCK（M）细胞。将等分样品（10μg蛋白质）置于SDS-PAGE和亲和纯化的免疫印迹兔抗Sync7多克隆抗体（兔抗Sync7#1）。总计MDCK细胞膜部分（10μg蛋白质）为亲和纯化山羊抗Syn7免疫印迹Syn7的多克隆抗体（B）或单独的兔抗体（兔反同步7#2）（C）。（D） 总膜分数（10μg蛋白质/车道）来自稳定转染HA的NRK细胞克隆（NRK-K2）对表位标记的Syn7进行免疫印迹分析单克隆抗HA抗体或兔抗Syn7#1。（E–J）兔子培育抗Syn7#1（E–G）或山羊抗Syn7抗体（H–J）不添加（E和H）、300μg/ml GST–Syn13（F和I）或300μg/ml GST–Syn7（g和J），然后标记MDCK细胞。图片为从单个焦平面采集并归一化以进行控制。（K–M）亚流利的MDCK细胞用Alexa标记Syn7488–结合二级抗体（top）与德克萨斯州特异性TfR（K）、EEA1（L）或CI-MPR（M）抗体红色结合二级抗体（底部）。Syn7标记为兔抗Syn7#1（K或L）或山羊抗Syn7抗体（M） ●●●●。通过收集4μm厚的z系列（步骤0.1）对细胞成像μm）并在之前对序列进行计算反褶积组装表示1-μm厚的最大点投影平面。箭头指向两个标记为正的结构，和箭头指向只有一个为正的结构标记。N、 核心。棒材，E–J为15μm；K–m为5μm。
图2
图2
Syn7和Syn13在WIF-B细胞中的分布共焦显微镜。极化WIF-B细胞被固定并渗透然后用Syn7和lgp120（A）、Syn13的抗体进行双重标记和lgp120（B），或Syn13和TfR（C）。小鼠单克隆抗体用于标记Syn7（A）、lgp120（B）和TfR（C）与兔多克隆抗体标记lgp120（A）和Syn13（B和C）。FITC-结合抗体小鼠IgG（A，Syn7；B，lgp120；C，TfR）和Cy3-结合抗体将兔IgG（A，lgp120；B和C，Syn13）作为次要抗体抗体。A和B中的光学部分穿过细胞，而C中的部分稍微靠近基底显示更多的外周内体。箭头指向以下结构两个标记为正值，箭头指向以下结构只有一个标记为阳性。注意Syn7与lgp120阳性结构，即溶酶体（A）和具有TfR的Syn13，即早期内体（C），而Syn13之间几乎没有重叠和lgp120（B）。BC，胆管样间隙；N、 核心。酒吧，10微米。
图3
图3
表位标记的Syn7在NRK细胞中的定位共焦显微镜。稳定转染NRK细胞表达HA表位标记的Syn7（NRK-K2细胞）被标记为HA，使用单克隆抗HA抗体（A、C和D，左侧）或兔抗HA多克隆抗体（B，左）与兔多克隆抗体结合Syn13（A，中间）抗体、TfR（B，中间）小鼠单克隆抗体、兔lgp120（C，中间）多克隆抗体或兔多克隆抗体EEA1抗体（D，中间）。E显示带有anti-lgp120的标签兔多克隆抗体（左）与抗EEA1单克隆抗体（中）。通过共聚焦从0.5μm焦平面采集图像显微镜检查。注意，Syn7分布的变化导致选择不同的焦平面来显示表位标记的Syn7与每个标记蛋白相关。绿色/红色合并图片显示在右侧。棒材，10μm。
图4
图4
免疫金电子显微镜定位MDCK细胞中的Syn7。（A） 超薄冰冻切片标记有随后，针对Syn7（抗Syn7#1）的特异性亲和纯化抗体通过15-nm蛋白质A–金。观察到特定标签（箭头）在与多泡相关的细胞的核周区域内体（e）。（B–D）细胞内MDCK膜用多聚甲醛并吸附到Formvar涂覆的网格上。膜是然后依次对Syn7（15-nm蛋白质A–金；S7）进行双重标记和CI-MPR（20-nm蛋白质A–金；MPR）（B）；Syn7（20-nm蛋白质A——黄金；S7）和Rab7（10-nm蛋白质A–金；R7）（C）；或Syn7（10-nm蛋白A–金；S7）和EEA1（15-nm蛋白质A–金）（D）。酒吧，300纳米
图5
图5
Syn7和Vamp 8的免疫金电子显微镜与大鼠肝脏晚期内体、溶酶体和杂种相关细胞器。Syn7（A–C）标记的免疫电子显微镜兔子抗Syn7#1的使用（15纳米金；大箭头），Vamp 8（E–G）标记（15-nm金；大箭头）和内化ASF-亲和素（A、B、E和G）（8纳米金；小箭头）与大鼠相关肝脏晚期内体（A和E）、杂交细胞器（B和F）和溶酶体组分（C和G）。晚期内体和杂交细胞器通过ASF-亲和素的含量鉴定。溶酶体通过其电子密度形态进行鉴定。条形，200 nm。（D和H）定量Syn7标记水平（D）和Vamp 8标记水平（H）在晚期内体的外周膜上（le；30μm评分），晚期内体-溶酶体融合后分离的杂交细胞器无细胞融合系统（h；65μm评分），分离溶酶体在以下条件下与细胞质和ATP孵育后无细胞融合系统（ly；1000μm评分）。误差条表示细胞器数量的SEM评分。
图6
图6
Syn7抗体特异性抑制晚期内体-溶酶体体外融合。（A） 滴定实验分析大鼠肝脏晚期内体和溶酶体的含量混合。影响Syn7#1亲和纯化兔抗体（闭合方块）和Syn7#2（闭合圈）和兔抗治疗后测量CI-MPR（开环）按照指示的抗体浓度分别进行分级在冰上放置15分钟，并在无细胞晚期内体-溶酶体融合试验。标准熔合（100%）定义为预孵育后获得的融合量仅缓冲液，即不添加抗体。数据包括以平均值±SEM表示六个独立样本的重复样本抗CI-MPR的实验，抗Syn7#1的五个单独实验在20μg/ml时，对40μg/ml的抗Syn7#1进行四次单独实验，20μg/ml的抗Syn7#2的三个单独实验和两个80μg/ml的抗Syn7#1的单独实验。所有其他数据呈现的是重复样本的方法。（B） 几个数的总和用指示抗体干扰融合分析的实验在晚期内体和溶酶体之间。融合前，两者都较晚仅用缓冲液（对照）或40μg/ml的以下抗体：抗CI-MPR，亲和纯化CI-MPR细胞溶质尾部抗体；抗Syn7#1，血清中Syn7细胞溶质结构域的亲和纯化抗体#1; absbd anti-Syn7#1，之前与anti-Syn 7#1预孵育被GST–Syn7吸收（相当于40时分析中的抗Syn7#1μg/ml）；抗Syn7#2，对胞浆的亲和纯化抗体来自血清#2的Syn7结构域；亲和纯化的抗突触融合蛋白6抗突触融合蛋白6胞质结构域的抗体；和反GST，GST亲和纯化抗体（40μg/ml）。反同步7（Fab），Fab以45μg/ml的速度使用从抗Syn7#2抗体制备的片段。提供的数据是重复样品的平均值或±SEM的平均值三个或更多单独实验的案例。
图7
图7
免疫荧光定位和Vamp 8与Syn7联合免疫沉淀。（A） 鞋面特异性8用MDCK的全细胞提取物证明抗体细胞SDS-PAGE和免疫印迹亲和纯化兔抗Vamp 8抗体。（B） 海卫一X-100–可溶部分由核后上清液制备从MDCK细胞中提取并与亲和纯化的兔抗Syn7抗体或兔抗GST抗体（左面板）或亲和纯化的山羊抗Syn7抗体和匹配的山羊抗GST抗体（右侧面板）。固定的金黄色葡萄球菌细胞然后添加，并清洗免疫沉淀物非还原性SDS-PAGE，并对Syn7、Vamp 8进行免疫印迹，和Vamp 3。五分之一的相应上清液来自免疫沉淀也被免疫印迹。对于兔抗Syn7#1抗体免疫沉淀山羊抗Syn7抗体用于免疫印迹分析。对于山羊抗Syn7抗体免疫沉淀兔抗Syn7#1抗体用于免疫印迹分析。SDS-PAGE在非还原条件下进行。（C） MDCK细胞标记有山羊抗Syn7（左）和兔抗Vamp 8（右）与FITC-结合的驴抗山羊和德克萨斯州红色偶联的驴抗兔二级抗体。匹配显示了去卷积的4μm厚z序列的1μm厚平面（D） 。极化WIF-B细胞固定并渗透，双标记兔抗Vamp 8（左）和鼠抗lgp120（右），以及通过共焦显微镜成像。主要抗体之后是Cy3-和FITC-结合二级抗体。在C和D中，箭头指向两个标记均为正的结构，和箭头表示仅包含一个标记的结构。不列颠哥伦比亚省，胆管样间隙；N、 核心。棒材，10μm。
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