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.2000年8月15日；20(16):5906-14.
doi:10.1523/JNEUROSCI.20-16-05906.2000。

蛋白激酶Cβ亚型在恐惧条件反射中的作用

E J韦伯 1, C M阿特金斯, J C塞尔彻, A W瓦尔加, B米尔尼乔, R付款人, M Leitges公司, J D斯威特
附属公司

蛋白激酶Cβ亚型在恐惧条件反射中的作用

E J韦伯等。 神经科学. .

摘要

蛋白激酶C家族的酶与许多动物物种的突触可塑性和记忆有关，但迄今为止，关于这类激酶的单个亚型的特定作用的信息很少。为了研究PKCβ亚型在哺乳动物学习中的作用，我们利用解剖、生物化学、生理和行为学方法对PKCβ基因缺陷的小鼠进行了表征。在我们的研究中，我们观察到PKCβ主要表达于新皮质、海马CA1区和杏仁核基底外侧核。缺乏PKCβ的小鼠表现出正常的大脑解剖结构和正常的海马突触传递、成对脉冲促进、长时程增强以及正常的感觉和运动反应。然而，PKCβ基因敲除的动物表现出学习能力的丧失；他们在线索和情境恐惧条件作用方面都存在缺陷。PKCβ基因敲除动物中PKC的表达模式和行为表型表明，PKC的β亚型在学习相关信号转导机制中起着关键作用，可能存在于杏仁核基底外侧核。

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数字

图1。
图1。
PKCβ在大脑中的分布。X-gal染色(A、 B类)在海马CA1中显示显著染色，在CA3中显示轻度染色。杏仁核、纹状体、体感皮层、小脑和内嗅/嗅周皮质区的外侧核和基底外侧核均可见中度染色。PKCβI亚型抗体的免疫组织化学研究(C、 D类)海马体基本上没有染色(C类)或者杏仁核(D类). 使用抗βII亚型抗体的免疫组织化学(E、 F类)海马CA1的起始层和放射层染色，而锥体层未染色(E类). 杏仁核(F类)基底外侧核纤维染色。中表示的结构D–F型从单个小鼠中获得，并并行处理。
图2。
图2。
海马CA1区Schaffer侧支突触的电生理反应。A类PKCβ缺失对25°C时PKCβ缺乏小鼠（○）或野生型小鼠（●）海马CA1区放射层的基线突触传递无影响。插入，先前基线突触传递的代表性轨迹（6个连续场EPSP的平均值）。校准：2毫伏，4毫秒。B类，PKCβ缺陷小鼠的配对脉冲促进作用也不受影响。
图3。
图3。
海马LTP。在以下实验中，从PKCβ缺陷小鼠（○）或野生型小鼠（●）获得的海马脑片被给予LTP诱导刺激(箭头)在稳定的基线反应后分娩，记录20分钟。每组破伤风由两组100 Hz的刺激组成，持续1秒，间隔20秒。A类，与野生型相比，突变海马脑片显示出正常的LTP，这是在一个适度的LTP诱导方案中，该方案包括一组破伤风，同时将脑片保持在25°C。B类，PKCβ缺陷小鼠在25°C下单组破伤风后，通过低频5Hz刺激（5min）测定的电位降低程度与野生型相同。C、 在使用更稳健的LTP诱导方案的实验中，未观察到PKCβ突变体LTP的差异，该方案包括三组100 Hz的破伤风，间隔10分钟，同时将切片保持在32°C的高温下。
图4。
图4。
PKCβ缺陷小鼠PKC缺乏代偿性变化。A、 顶部，PKCβ敲除物、对照小鼠或纯化的PKCβII蛋白的海马匀浆中PKCβ、PKCα和PKCγ蛋白的代表性西方分析。底部，PKCβ基因敲除小鼠与对照小鼠中蛋白激酶C表达的百分比变化显示了每种钙2+-依赖性蛋白激酶C亚型。所有PKC密度测量值均归一化为从整个海马匀浆中获得的相应总蛋白量。PKCα的PKC表达水平无统计学意义的变化(n个=4）或PKCγ(n个= 4).N个/D、，无法检测到。B类，磷酸酯酶诱导的突触传递增强在PKCβ缺陷小鼠中降低。结果显示，25分钟的5μ米对照组（+/+；n个=4）和PKCβ缺乏（−/−；n个=7）海马切片。对照组与敲除组小鼠的差异具有统计学意义(第页<0.01），并且与生化数据一致，表明PKCβ缺陷小鼠中缺乏其他PKC亚型代偿性变化。
图5。
图5。
恐惧条件反射。左侧，我们对PKCβ基因敲除小鼠（○）和同窝野生型小鼠（●）的初步发现进行了比较。正确的，使用一组幼稚PKCβ缺陷小鼠和年龄匹配的C57BL/6对照小鼠复制这些实验。A类，PKCβ缺乏或野生型小鼠训练当天的冷冻行为。野生型小鼠在休克反应中表现出明显更高的冷冻水平(第页<0.05）比PKCβ基因敲除小鼠的初始结果好，但重复实验时，这种差异不显著。声学CS分为两个阶段下划线的脚电击出现在箭头.B、，在最初的结果中，PKCβ缺陷小鼠在训练环境中对替代物的反应表现出明显更少的冷冻(第页<0.01）。在第二个实验中重复了这种效果(第页< 0.01).C类在这些实验中，动物所处的环境与训练它们的环境不同。声学CS演示由线在两个初始实验中，PKCβ基因敲除小鼠在训练24小时后出现CS后，其冷冻反应受损(第页<0.01）和复制实验(第页< 0.001). 对于所有图表，每5秒对冻结进行一次评分，并在1分钟内进行平均。
图6。
图6。
A类被动回避、热板、电击阈值和脉冲前抑制。被动回避测试了从亮舱到暗舱的阶跃延迟。这项测试利用了老鼠在训练过程中从亮区退到暗区的自然倾向。在进入黑暗区域时，给予轻微的足部电击，学习被评估为在训练课程结束后避开黑暗区域。结果显示为PKCβ缺陷小鼠（■）或野生型小鼠训练后1-3天试验期间的逐步潜伏期(▪); 平均值±SEM。采用热板试验比较突变型（■）和野生型(▪) 对有害刺激的敏感性。在55°C的热板上测量热伤害感受，作为后爪舔的潜伏期。作为对热板试验的额外控制，电击阈值试验用于比较通过畏缩、跳跃或发声程度测量的对脚部电击的敏感性，以增加脚部电震强度。老鼠对大噪音通常会表现出惊吓反应。有趣的是，如果在响亮的噪音之前出现适度的噪音，惊吓反应会显著减弱，这种现象称为脉冲前抑制。预脉冲抑制是评估感觉运动门控和听力的一项非常敏感的测试，因为动物对预脉冲的反应在数量上是不同的，变化幅度只有几分贝。pretone（以分贝为单位的声音强度）对减小声震震级的影响如图所示底部图形结果是PKCβ缺陷小鼠（■）或野生型小鼠（●）随后120dB惊吓反应力的减少百分比。B类，开放字段行为。作为一般活动水平测试和焦虑测试，使用野外测试对动物进行监测。在这个测试中，一般的活动水平是通过测量水平活动、垂直活动和在照明房间的开放式盒子中进行10分钟测试期间的总行程来评估的。旷野测试也测量焦虑水平，通过中心距离与总距离的比率进行评估。结果显示PKCβ缺陷小鼠（○）或野生型小鼠（●）；平均值±SEM。顶部图表，30分钟内每分钟行驶的总距离。底部图形。30分钟内每分钟中心距离与总行驶距离的比率。各组之间的总行程或中心与总距离的比率没有差异。突变体的总体垂直活性略有下降（数据未显示）。C类，Rotarod行为。我们使用旋转试验分析了协调和运动技能的获得。动物在旋转杆上停留的时间是衡量其整体协调水平的指标。老鼠也通过训练来提高他们的表现，这是运动学习的一个指标。结果显示，动物在每个训练期间停留在旋转杆上的总次数。在一天内进行了三次训练试验。动物停留在杆上的时间的增加被视为运动学习的指标。结果显示PKCβ缺陷小鼠（○）或野生型小鼠（●）；平均值±SEM。
图7。
图7。
在第3天对PKCβ缺陷小鼠和对照小鼠进行再训练。A类对PKCβ缺陷小鼠（○）或对照小鼠（●）进行再训练时的冷冻行为。在线索和上下文测试后的一天（第3天），用五对声学CS对这些小鼠进行再训练(暗条)和脚部休克(灰色箭头). 与对照组小鼠相比，PKCβ基因敲除小鼠在基线测量期间表现出明显更低的冷冻水平（1-2分钟；第页< 0.05). 这种冷冻不足随着过度训练而消失（第3-7分钟）。B类，在第3天的培训后1-2小时，根据CS演示进行冻结。PKCβ基因敲除小鼠和对照组对CS反应的冷冻水平没有显著差异。C类，根据第4天的培训背景陈述，冻结。PKCβ基因敲除小鼠在训练环境下的冷冻行为受损(第页< 0.05).D类，在第4天的CS演示中冻结。PKCβ缺陷小鼠对CS的反应也明显低于对照组(第页< 0.01). 在所有实验中，每5秒对冻结进行一次评分，并在1分钟的时间内进行平均。
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