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.2000年7月；20(13):4494-504.
doi:10.1128/MCB.2013.4494-404.2000。

神经生长因子信号级联中非典型蛋白激酶C的定位：与PC12细胞分化和存活的关系

M W Wooten先生 1, M L Seibenhener先生, K B奈迪赫, M L范登普拉斯
附属公司

神经生长因子信号级联中非典型蛋白激酶C的定位：与PC12细胞分化和存活的关系

M W Wooten先生等。 分子细胞生物学. 2000年7月.

摘要

非典型蛋白激酶C（aPKC）参与神经生长因子（NGF）信号传导的途径尚不清楚。我们之前报道过，在PC12细胞中，NGF诱导的分裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活独立于经典和非经典PKC亚型，而NGF诱导分化需要PKC亚型别。NGF诱导的PKC iota激活依赖于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），并导致PKC iota与Ras和Src的共缔合。Src（DN2）或Ras（Asn-17）显性阴性突变体的表达损害了NGF对PKC iota的激活。在Raf-1水平上，活化不需要PKC-iota或PI3激酶；然而，PKC-iota可以弱激活MEK。PKC-iota活性和PI3K抑制剂对NGF诱导的MAPK或p38活性没有影响，但降低了NGF刺激的c-Jun N末端激酶活性。Src、PI3K和PKC-iota同样需要NGF诱导的NF-kappaB活化和细胞存活，而Ras既不需要存活也不需要NF-kapbaB活化，但需要分化。IKK与PKC-iota、Src和IkappaB以复合体的形式存在。与Src在调节NF-kappaB活化中的作用一致，Src活性的缺失会损害PKC-iota向IKK复合体的募集，并显著损害NGF诱导的p65/NF-kappaB-细胞核移位。这些发现表明，在PC12细胞中，aPKC包含一个分子开关，用于调节NF-kappaB下游的分化和存活反应。基于这些发现，Src成为PKC-iota和NF-kappaB通路的关键上游调节器。

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数字

图1
图1
药物对aPKC活性的影响。在添加NGF（100 ng/ml）15分钟之前，用沃特曼（Wort；50、100或200 nM）、LY294002（Ly；25、50或100μM）或白屈菜红碱氯化物（CH；3、6或9μM）预处理PC12细胞1小时。使用MBP作为底物的免疫复合物激酶分析法对PC12细胞裂解物（400μg）进行三次aPKC活性分析。所示数据为三个独立实验平均值的平均值±标准误差。N、 NGF公司。
图2
图2
PKC-Ⅰ与Ras和Src共伴生。（A） 如指示，用NGF（100 ng/ml）刺激PC12细胞0至15分钟。制备细胞裂解物（500μg），并用Ras或Src抗体免疫沉淀（IP），然后用PKC-Ⅰ抗体免疫印迹（WB）。作为标准加入分析的是PC12细胞全细胞裂解物（WCL；70μg）。作为阳性对照，用Ras、Src或PKC-Ⅰ抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物（50μg）。（B） 控制，Ras−，或Src−用NGF（100 ng/ml）刺激PC12细胞0至60 min，然后用MBP为底物的免疫复合物激酶分析法分析三份aPKC活性。该实验重复了另外两次，结果相似。
图3
图3
Ras、Src和aPKC相对于Raf-1的定位。（A） 控制，Ras−，或Src−用NGF（100 ng/ml）刺激PC12细胞0至30 min。裂解后，用SDS-PAGE（7.5%聚丙烯酰胺）溶解等分蛋白，然后用Raf-1抗体进行免疫印迹。（B） 在添加NGF（100 ng/ml）15分钟之前，用沃特曼（Wort；50或100 nM）、LY294002（Ly；25或50μM）或白屈菜红碱氯化物（CH；3或6μM）预处理PC12细胞1小时。裂解后，用SDS-PAGE（7.5%聚丙烯酰胺）溶解等分蛋白质，然后用Raf-1抗体进行免疫印迹。C、 控制；N、 NGF公司。（C） 用对照构建体、突变体PKC-ι（I静音)或突变PKC-ζ（Z多用途终端). 此后，如图所示，用NGF（100 ng/ml）刺激细胞0或15分钟。裂解后，用SDS-PAGE（7.5%聚丙烯酰胺）溶解等分蛋白质，然后用Raf-1抗体进行免疫印迹。根据NGF刺激Raf-1过度磷酸化/活化的能力（如相对分子量增加或凝胶位移（–––）所示），对样品进行+评分。这些实验重复了另外两次，结果相似。右侧显示了66 kDa的频带。
图4
图4
PKC-Ⅰ激活MEK。（A） 用NGF（100 ng/ml）刺激PC12细胞15分钟，然后用Raf-1免疫沉淀（IP），并进行体外激酶反应，如[γ]所示-32P] 1μg重组MEK1存在下的ATP。样品通过SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺）分离，然后进行放射自显影。显示了自磷酸化的PKC-Ⅰ和磷酸化的MEK1。尺寸以千道尔顿表示。（B） 如前所述，使用免疫复合物激酶测定法测定MEK1活性（48）。活性的相对变化被归一化为NGF处理的相对变化。在其他两个实验中也得到了类似的结果。N、 NGF公司。
图5
图5
Ras、Src和aPKC相对于MAPK和p38的定位。（A） 控制，Ras−，或Src−用NGF（100 ng/ml）刺激PC12细胞0至30 min。裂解后，用SDS-PAGE（12%聚丙烯酰胺）溶解等分蛋白（70μg），然后用抗磷酸-MAPK或-p38抗体进行免疫印迹。剥离印迹，并用MAPK或p38的非磷酸特异性抗体进行复制。（B） 在添加NGF（100 ng/ml）15分钟之前，用沃特曼（Wort；50或100 nM）、LY294002（Ly；25或50μM）或白屈菜红碱氯化物（CH；3或6μM）预处理PC12细胞1小时。裂解后，用SDS-PAGE（12%聚丙烯酰胺）溶解等分蛋白质（70μg）然后用抗磷酸-MAPK或-p38抗体进行免疫印迹。这个实验重复了三次，结果相似。C、 控制；N、 NGF公司。
图6
图6
Ras、Src和aPKC相对于NF-κB的定位。（A） PC12，Ras公司−，高级−或用NGF（100 ng/ml）刺激过度表达c-Src的细胞0至6 h。裂解后，等量蛋白等分样品进行EMSA分析。（B） 用姜黄素（Cu；5或20μM）、PD98059（PD；15或60μM）或SB202190（SB；5或20μM）预处理PC12细胞，然后加入NGF（100 ng/ml）3小时。裂解后，对相等的蛋白质等分试样进行EMSA分析。（C） 在添加NGF（100 ng/ml）3 h之前，用沃特曼（Wort；25至200 nM）或LY294002（Ly；12.5至100μM）预处理PC12细胞1 h。裂解后，等分蛋白质进行EMSA分析。这个实验重复了两次，结果相似。
图7
图7
Src调节IKK与aPKC的关联。PC12细胞，亲代或Src−，用NGF（100 ng/ml）处理指定时间，用抗IKK免疫沉淀裂解物（500μg）。免疫沉淀物（IP:IKK）或裂解物（50μg）作为阳性对照，用PKC-Ⅰ、Src和IκB抗体进行免疫印迹（WB）。这个实验重复了两次，结果相似。
图8
图8
PKC-Ⅰ/IκB共结合需要Src。（A） 用NGF（100 ng/ml）处理PC12细胞指定的时间，并用抗IκB免疫沉淀（IP）裂解物。沉淀用PKC-Ⅰ抗体进行免疫印迹（WB）。（B） PC12细胞、用染料木素（Gen；20μM）或Src预处理的细胞−用NGF（100 ng/ml）处理细胞达到指定时间，用抗PKC-Ⅰ免疫沉淀裂解物。沉淀用IκBα印迹。（C） PC12或Src−将细胞暴露于NGF（100 ng/ml）30 min。分离细胞核并用抗p65/NF-κB抗体进行免疫印迹。（D） PC12或Src−将细胞暴露于NGF（100 ng/ml）30 min。制备全细胞裂解物（50μg）并用IκB抗体进行免疫印迹。对印迹进行扫描，IκB强度的相对变化如括号所示。
图9
图9
说明aPKC在NGF信号级联中的相对定位以促进生存和分化的模型。aPKC可以激活MEK并位于JNK的上游。Ras和Src都位于aPKC的上游，PI3K也是如此，而aPKC位于NF-κB的上游，直接与IKK相互作用。分化需要Src和Ras途径的组成部分。分化途径与通过Src、aPKC和PI3K的生存途径的组成部分重叠。生存信号传导与Ras无关，但依赖于PI3K、Src、aPKC和NF-κB。我们的研究结果支持一个模型，即aPKC占据一个关键节点，能够通过MEK和JNK的调节以及NF-κB上游与Ras-MAPK相互作用。NGFR，NGF受体。
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